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近年来,食物过敏性疾病的发病率迅速增高。随着克氏原螯虾消费量的日益增长及加工产品多样化,其引发的食物过敏病例常有出现,严重地影响着人们的生活质量。所以,针对克氏原螯虾引起过敏问题的研究具有重要意义。本文以克氏原螯虾为试验对象,继续寻找新型过敏原,研究其分离纯化、理化特性分析及抗原表位的确定,为开发低致敏性克氏原螯虾产品提供理论依据,同时为甲壳类过敏性疾病的诊断和治疗提供帮助。利用甲壳类过敏患者血清Ig E的Western-blotting技术,确定克氏原螯虾肌肉中28 k Da蛋白为其过敏组分。采用硫酸铵分步盐析、连续柱层析(Q-Sepharose、Sephacryl S-200)的方法纯化得到28 k Da蛋白,经肽指纹质量图谱鉴定其为磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,TIM),并通过免疫新西兰兔制备抗TIM多克隆抗体。理化特性分析结果显示,TIM是一种糖含量为0.82%的糖蛋白;TIM不耐热,高温处理可破坏其二级结构导致其Ig E结合活性明显下降;TIM在强酸、强碱条件下不易被降解,但强碱处理使其Ig G结合活性下降,而强酸环境使其Ig E结合活性有所上升;TIM耐胰液消化,易被胃蛋白酶降解但其消化产物仍存在Ig E结合活性;TIM存在多态性,含TIM1、TIM2、TIM3三种亚基,且TIM1、TIM2具有免疫活性;TIM的空间结构为典型的(β/α)8-barrel结构,分析模拟出6个构象型Ig G表位和5个线性Ig G表位。与此同时,实验还发现克氏原螯虾肌肉中90 k Da蛋白可与兔抗克氏原螯虾TIM多克隆抗体发生特异性结合且具有Ig E结合活性,分析其为一种新型过敏组分。采用硫酸铵分步盐析及阴离子交换柱层析(Q-Sepharose)的方法纯化得到90 k Da蛋白,经肽指纹质量图谱鉴定其为细丝蛋白c(filamin C,FLN c)。理化特性分析表明,FLN c含糖量为0.98%;FLN c对热不稳定,高温处理可破坏其二级结构使其Ig E结合活性显著下降;FLN c耐碱不耐酸;FLN c可被消化酶降解,但其消化产物仍保留免疫活性;FLN c具有复杂的空间结构,分析模拟出8个构象型Ig G表位和9个线性Ig G表位,且与TIM存在多个相同抗原表位区域。在此基础上,深入探索了克氏原螯虾TIM与FLN c的相互结合关系。采用噬菌体展示技术,分析发现与FLN c结合的TIM位点主要有3个构象型结合位点和3个线性结合位点,与TIM结合的FLN c位点主要有8个构象型结合位点和6个线性结合位点,判定TIM和FLN c存在相互结合。