研究背景1,3-丁二烯(1,3-butadiene,BD)是一种重要的工业原料,用于合成橡胶、塑料等石油化工和制造行业。美国将BD列为前40位重要的化学品之一,应用范围广,职业接触人群多。此外,汽车尾气、香烟烟雾及食用油油烟中也发现BD普遍存在,属于室内具有慢性空气危害的9种优先污染物之一。因此BD不仅是一种职业暴露污染物,更是一种重要的环境空气污染物,其危害范围已从职业工人扩展到普通人群。BD可以诱导啮齿动物多器官肿瘤的形成,人群研究也显示出白血病发病相关的阳性结果,因而被IARC和EPA列为确定的人类致癌物(1组)。BD的致癌效应主要来自于体内代谢产生的环氧化产物:1,2-环氧-3-丁烯(EB),1,2-二羟基-3,4-环氧丁烯(EBD)和1,2:3,4-二环氧丁烯(DEB)。上述环氧化产物均能与DNA形成加合物,造成遗传物质的损伤,其中DEB的活性最强,因而目前对BD致癌机制研究多聚焦于阐明其遗传损伤效应。既往研究发现BD及其代谢物可以诱导DNA双链断裂和染色体损伤,但是BD诱导DNA双链断裂损伤后的修复机制并不清楚。本课题组前期在人群研究中发现BD暴露与核质桥(NPB)比例升高相关。NPB是染色体损伤的标志和细胞癌变的重要环节,研究BD诱导NPB形成的机制,将为阐明BD的致癌作用过程,预防和减少BD所诱导的染色体损伤和人群肿瘤的发生提供重要依据。有研究提示,NPB的形成可能与DNA双链断裂后,经非同源末端连接(NHEJ)等错误修复形成双着丝粒染色体,在细胞分裂后期分别牵引到两个子细胞核有关。由此我们推测,BD及其代谢物诱导DNA双链断裂后,可能通过影响主要的DNA双链断裂修复通路,即HR和NHEJ修复通路,造成错误修复效率的提高,从而引起NPB形成。因此,本课题以BD活性代谢物DEB为对象,在明确其诱导人淋巴母细胞DNA双链断裂和染色体损伤的条件下,研究DEB对DNA双链断裂修复通路的影响,进一步验证修复通路在DEB致NPB形成中的作用,为深入探讨BD的遗传损伤机制提供依据。研究内容1.DEB的细胞毒性效应研究建立DEB染毒处理的人淋巴母细胞TK6细胞模型模型。分别采用MTS和Ed U方法检测DEB对细胞活性和增殖能力的影响。采用流式细胞仪分析技术,分别以PI和Annix V-FITC/PI染色检测DEB对细胞周期和细胞凋亡的影响。2.DEB诱导细胞遗传损伤的检测采用胞质分裂阻滞微核试验(CBMNT)分析DEB对细胞染色体的损伤(微核率、核质桥率、核芽突率及核分裂指数);采用Western blot和免疫荧光技术,检测DNA双链断裂标志物(γ-H2AX)的表达情况。3.DEB对细胞DNA双链断裂损伤修复的影响采用含有HR修复效率检测报告底物的MCF-7细胞,检测DEB处理后HR修复效率的变化。采用Cell-free方法,提取细胞总蛋白,与32P标记的线性质粒共同作用,检测DEB处理后NHEJ修复效率的变化。采用Western blot、Slot blot或免疫荧光方法检测DNA损伤修复通路关键分子ATM、p-ATM、γ-H2AX、Ku80、DKA-PKcs、XLF、DNA-ligase IV和BRCA1的表达,以观察DEB对DNA双链断裂修复通路分子表达的影响。4.NHEJ通路基因在DEB所致染色体损伤中的作用研究采用化学抑制剂Nu7026处理细胞以抑制DNA-PKcs的表达,采用Sh RNA转染细胞以抑制Ku80的表达,通过CBMNT检测细胞染色体损伤的变化,分析NHEJ通路在DEB所致DNA双链断裂损伤修复及NPB形成中的作用。研究结果1.DEB诱导TK6细胞增殖抑制、周期阻滞和细胞凋亡DEB可以抑制TK6细胞的活力,降低DNA的合成,具有剂量效应关系。进一步通过流式细胞仪分析发现,DEB可以抑制TK6细胞的周期进展,使细胞分裂阻滞在G2/M期。同时,DEB处理可诱导TK6细胞凋亡,2.5~10μM DEB处理后48 h,细胞凋亡率均出现显著升高(P<0.01或0.001)。2.DEB诱导TK6细胞的染色体损伤及DNA双链断裂CBMNT检测结果表明,DEB可诱导TK6细胞的微核率、核质桥率及核芽突率升高,造成细胞的染色体损伤,同时引起核分裂指数降低,抑制细胞增殖。此外,Western Blot检测发现,10μM DEB处理细胞后,DNA双链断裂标志物γ-H2AX蛋白的表达随着时间的延长,先升高后降低,总体维持在一个高表达的水平。免疫荧光检测也证实,10μM DEB处理可诱导细胞γ-H2AX的大量表达。上述结果提示,DEB可造成TK6细胞的DNA双链断裂及染色体损伤。3.DEB影响HR和NHEJ修复效率及相关基因的表达采用含有p DR-GFP底物的细胞检测DEB对HR修复效率的影响,结果显示,DEB处理24 h后反映HR修复的荧光阳性细胞比例显著降低,并存在剂量效应关系,提示DEB可降低细胞的HR修复效率。体外NHEJ修复检测结果表明,随着DEB处理浓度增加,线性化质粒DNA连接产物明显增加,提示DEB可提高DNA双链断裂的NHEJ修复效率。此外,对DNA双链断裂损伤修复通路的蛋白表达检测结果表明,HR通路BRCA1蛋白在DEB处理24 h时出现明显降低。同时,NHEJ通路蛋白DNA-PKcs、XLF和DNA-ligase IV的表达在DEB作用后4 h或24 h后开始出现显著升高。Western blot检测未发现NHEJ修复通路核心蛋白之一Ku80的表达改变,但是免疫荧光和Slot blot检测显示DEB处理细胞后4 h,Ku80蛋白形成聚焦灶,同时与DNA结合的Ku80含量显著升高,并存在剂量效应关系。上述结果提示DEB可降低HR修复通路效率及相关基因表达,但是提高NHEJ修复通路效率,以及相关基因表达或转移结合到DNA的能力。4.NHEJ通路参与DEB诱导的NPB形成采用化学抑制剂和sh RNA分别抑制DNA-PKcs和Ku80蛋白,通过CBMNT,观察NHEJ通路在DEB诱导染色体损伤和NPB形成中的作用。检测发现,与单纯DEB处理组相比,抑制DNA-PKcs表达可使DEB诱导的微核和核芽突比率显著升高,而NPB比率显著降低。同时,与转染阴性对照序列的细胞相比,在稳定转染Ku80 sh RNA的细胞中,DEB也能诱导微核和核芽突比率进一步升高,而NPB比率则显著降低。这些研究结果提示,抑制DNA-PKcs或Ku80蛋白的表达可加重DEB所诱导的微核及核芽突损伤,但减低了NPB损伤的发生。这一结果也提示NHEJ通路可能参与了DEB所诱导的NPB的形成。研究结论:DEB可诱导TK6细胞的DNA双链断裂和微核、核芽突以及核质桥等染色体损伤,引起细胞增殖抑制、周期阻滞和凋亡。同时,DEB引起DNA双链断裂损伤修复通路中HR修复通路的抑制和NHEJ修复通路的激活,NHEJ修复通路参与DEB诱导的核质桥的形成。