研究背景及研究目的:生物反应器是组织工程骨体外培育的关键设备,其技术的不断发展和完善为组织工程骨的体外培育提供了更广阔的技术平台。但当前用于组织工程骨体外培育的生物反应器仍存在多方面的不足:①自动化、智能化程度低,培养过程仍需大量的手工操作,易于污染;②缺少对施加刺激的反馈调节功能,导致刺激因素不稳定;③施加刺激因素单一,仿生效果差;④多需要孵箱等辅助设备。以上缺点和不足导致当前的生物反应器不能适应组织工程骨产业化、商品化生产的需求,不能满足高水平科学研究对施加因素精确控制的要求,同时,也很难构建体外组织工程骨的仿生培育环境。本课题研制了一种智能化组织工程组织仿生培育系统,制作了样机一台,并对样机及各部件的机械性能和组织培育性能进行检测,并应用智能化组织工程组织仿生培育系统样机培育组织工程骨,观察压应力对组织工程骨培育效果的影响,初步探求适合于组织工程骨体外培育的力学环境,为进一步研究压应力促进MSCs增殖及分化的机制提供了重要实验依据。方法: 1、依据现代仿生学理念设计智能化组织工程组织仿生培育系统样机,应用中空纤维半透膜制作气液和液液组合式交换器、应用高敏度感受器及PLC控制系统制作智能化反馈系统、应用医用高分子材料及精加工技术制作组织工程骨培养室。对智能化组织工程组织仿生培育系统的机械性能、流量、恒温效果、无菌性能、气/液和液液交换性能进行检测,鉴定其作为组织工程骨培育平台的性能;2、采用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法获取人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells hMSCs),并对获取的hMSCs进行表面标记物和成骨分化鉴定。应用胶原凝胶双相接种法构建组织工程骨,将构建的组织工程骨分为对照组和实验组,对照组置于孵箱内静置培养,对实验组施加频率分别为0.5 Hz、1.0 Hz、2.0 Hz,压缩幅度分别为2%、5%、10%、15%、20%的压应力刺激,2h/d。各时间点光镜观察细胞形态,扫描电镜及HE染色观察培育的组织工程骨。MTT法、DNA含量检测和流式细胞技术检测细胞增殖水平及生长周期,观察不同频率及幅度的压应力对MSC增殖作用的影响;通过钙含量检测、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ALP)活性测定及骨钙素免疫组织化学染色观察不同频率及幅度的压应力对MSCs分化成骨作用的影响。结果:1、成功制作了智能化组织工程组织仿生培育系统样机一台,实现了对组织工程骨的自动化培育,对培育环境进行智能化反馈调节,整机性能稳定,精确度高。2、成功制作了骨、软骨培养室,内部容积为157.8ml。3、样机的循环动力组件伸缩泵伸缩范围为:0—15mm,可调增量为:0.1mm。运行模式为连续和间歇两种(时间可调),其控制的培养液流动速度范围为:0—143.2ml/分。4、样机的压应力施加装置其行程为:0—48mm。可调增量为:0.1mm。运行起点和运行终点于0—48mm范围内可调,运行模式为:连续和间歇。5、培养舱内温度设定范围为:22—40℃,在设定温度为37℃的情况下,温度稳定在36.9—37.1℃之间。6、连续观察、检测在样机培养液循环系统内循环流动三周的培养液无细菌生长。7、通过充入气体的改变,样机中的气液及液液组合式交换器可将培养液的pH值在6.55—8.37范围内调节,将培养液的PCO2在8—150mmHg范围内调节,将培养液的PO2在112—385mmHg范围内调节。将构建的组织工程骨在智能化组织工程组织仿生培育系统样机内连续培养14天,其pH值变化范围为7.33—7.463,PCO2变化范围为:13.325—14.725mmHg,PO2变化范围为:183.5—199.75mmHg。变化幅度明显小于平皿培养法的pH值变化范围:7.663—7.152,PCO2变化范围为:13.325—18.35mmHg,PO2变化范围为:199.75—177mmHg。8、扫描电镜观察发现10%压缩幅度、0.5Hz的压应力刺激作用下培育的组织工程骨孔隙表面覆盖大量的细胞,方向一致,分布均匀,细胞密度明显高于对照组。而20%压缩幅度、0.5Hz及10%压缩幅度、2.0Hz的压应力刺激作用下培育的组织工程骨孔隙内部仅可见少量的细胞生长,分布较均匀,排列不齐,形态不规则,细胞密度明显低于对照组。组织切片观察可见0.5Hz、10%压缩幅度的压应力刺激作用下培育的组织工程骨支架中细胞数量明显多于对照组,细胞分布更均匀,基质分泌较多。而2.0Hz、20%压缩幅度的压应力刺激作用下培育的组织工程骨支架材料中仅可见少量的细胞生长,基质分泌少,细胞密度明显低于对照组。9、当压缩频率分别为0.5 Hz、1.0 Hz,压缩幅度分别为2%、5%、10%时,压应力刺激可促进hMSCs增殖;压缩幅度为15%、20%时压应力刺激抑制细胞增殖,其中以压缩频率为0.5 Hz、压缩幅度为10%的压应力刺激细胞增殖效果最为显著,生长曲线比对照组明显前移,S期细胞百分比(27.45±0.25)%较对照组(19.15±0.26 )%增高43.34%,21天时DNA含量是培养0天时的291.95%,较对照组升高43.72%,当压缩频率为2.0 Hz时,各压缩幅度的压应力均抑制细胞增殖,以压缩幅度为20%组最为明显,S期细胞百分比(4.25±0.89)%较对照组(19.15±0.26 )%降低了77.81%,21天时DNA含量虽较培养0天时升高183.07,但较对照组降低4.25%。10、ALP活性检测示5%的压缩幅度、0.5Hz的压应力刺激可明显提高ALP活性,而20%的压缩幅度、2.0 Hz的压应力刺激可明显抑制ALP活性的表达。钙含量检测提示21天时,0.5Hz条件下,2%、5%、10%、15%幅度的压应力均可使钙含量较对照组明显提高(P<0.05),以5%幅度、0.5Hz及10%幅度、0.5Hz组最为明显,而当压缩幅度为20%时和2.0 Hz、10%压缩幅度及2.0 Hz、15%压缩幅度压应力刺激组钙含量均较对照组明显降低(P<0.05),以2.0 Hz、20%压缩幅度组最为明显。骨钙素免疫组织化学染色提示5%幅度、0.5Hz压应力刺激作用条件下细胞骨钙素表达阳性率高,20%幅度、2.0Hz压应力刺激作用条件下细胞骨钙素表达阳性率低。结论:1、智能化组织工程组织仿生培育系统样机整体及各功能组件机械性能稳定,可对培育的组织工程骨施加多种形式的仿生应力刺激及稳定的培育微环境,可同时进行四组组织工程骨的培育,达到智能化、自动化、产业化培育组织工程骨的要求。2、智能化组织工程组织仿生培育系统密闭及无菌性能良好,提供的培育条件可满足组织工程骨长期培育的要求;其组件组合式气液及液液交换器可为组织工程骨长期培育提供更稳定的微环境;应力施加性能精确度高,可自动调节;变容式伸缩泵可提供脉冲式仿生液流。3、压应力对hMSCs的增殖有重要影响,hMSCs对压应力刺激的感受存在一“窗口”范围。适当强度的压应力可促进hMSCs的增殖,0.5Hz的压缩频率、10%的压缩幅度是促进hMSCs增殖及成骨分化的适合强度,当压缩幅度小于5%时对hMSCs增殖的促进作用不明显,而当频率为2.0Hz或压缩幅度为20%时,则对hMSCs的增殖起抑制作用。4、压应力对hMSCs的成骨分化有重要影响,hMSCs对压应力刺激的感受存在一“窗口”范围。适当强度的压应力可促进hMSCs的成骨分化,0.5Hz的压缩频率、5%～10%的压缩幅度是促进hMSCs成骨分化的适合强度,当压缩幅度小于5%时对hMSCs成骨分化的促进作用不明显,当压缩幅度大于10%时,随着压缩幅度的增大,促进成骨分化的作用则逐渐减小。而当频率为2.0Hz或压缩幅度为20%时,则对hMSCs的增殖及成骨分化起抑制作用。5、智能化组织工程组织仿生培育系统可为组织工程骨的培育提供适宜的压应力刺激及稳定的培育微环境,促进组织工程骨的成熟。