论文部分内容阅读
一些研究证实,天然多糖经过硫酸化修饰,使其增强了或产生了新的生物活性。为了提高中药多糖的生物活性,获取更多的硫酸化多糖,可通过硫酸化修饰对其进行结构改造。大枣多糖是大枣中重要的生物活性物质,具有增强免疫、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、抗炎等多方面的生物活性,为了追踪大枣多糖抗病毒和增强免疫的活性部位和硫酸化修饰提高其抗病毒和增强免疫活性的可能性,本研究首先用分步醇沉法提取分级大枣多糖,测定它们的体外抗病毒和增强免疫的活性,筛选出效果较好的活性部位,进一步进行硫酸化修饰,比较了其修饰前后抗病毒活性的变化。试验分为以下五个部分：试验1、大枣多糖的提取 分别用水煎一步醇沉和水煎分步醇沉法从干燥大枣中提取大枣总多糖JPSt和4种分级多糖JPS50、JPS60、JPS70和JPS80,用蒽酮一硫酸法测定多糖含量。结果表明,各多糖的提取率以JPSt最高、达6.59%,各分级多糖的提取率以JPS50最高、达2.53%；各多糖的糖含量以JPS50最高、达52.1%。试验2、大枣多糖抗病毒活性部位的体外筛选首先测定大枣总多糖JPSt和4种分级多糖JPS50、JPS60、JPS70、JPS80对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度,取安全浓度范围内5种浓度的各多糖与鸡新城疫病毒(NDV)以3种加药方式(先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加)加入到培养成单层CEF中,用MTT法测定各多糖对NDV感染CEF能力的影响。结果表明,先加多糖和后加多糖时,JPS50组病毒抑制率高于其他各组。多糖与病毒感作后加时,JPS70组病毒抑制率高于其他各组。综合比较以JPS50的效果最好,是大枣多糖抗病毒的最佳活性部位。试验3、大枣多糖增强免疫活性部位的体外筛选取安全浓度范围内5种浓度的大枣总多糖JPSt和4种分级多糖JPS50、JPS60、JPS70、JPS80加入到培养的鸡外周血淋巴细胞中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果表明,JPS50和JPS60在2.442-39.063μg·mL-1能显著刺激淋巴细胞增殖,JPS50、JPS60在2.442～39.063 μg·mL能协同PHA刺激淋巴细胞增殖。综合评价以JPS50的效果最好,是大枣多糖增强免疫的最佳活性部位。试验4、大枣多糖硫酸化修饰条件的优选以纯化的JPSt为材料,然后以产物量和取代度为指标,用L9(34)正交试验对大枣多糖氯磺酸-吡啶法硫酸化修饰条件的反应温度、试剂配比、反应时间进行优选。结果表明,试剂配比和反应温度分别对产物量和取代度的影响最大,氯磺酸与吡啶配比为1：4时产物量最高,反应温度为85℃时取代度最高。综合考虑最适宜的修饰条件为反应温度85℃、氯磺酸与吡啶配比为1：4、反应时间1 h。试验5、硫酸化大枣多糖抗病毒活性的体外比较测定sJPSA、SJPS50、JPSa、JPS50和JPSt对鸡胚成纤维细胞的安全浓度,然后取安全浓度范围内5种浓度的各多糖与鸡新城疫病毒以3种加药方式加入到培养成单层的CEF中,用MTT法测定各多糖对NDV感染CEF能力的影响。结果,先加多糖和多糖与病毒感作后加入时,sJPS50、sJPSA的病毒抑制率显著高于未修饰的大枣多糖；后加多糖时各组的病毒抑制率差异不显著,但sJPs50组最高。表明,硫酸化修饰可以提高大枣多糖的抗病毒活性,综合比较以sJPS50的作用最强,且与硫酸基取代度和糖含量有一定的相关性。