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研究背景TIMAP(TGF-β inhibited membrane-associated protein)-转化生长因子(TGF-β)抑制的膜蛋白,是我们课题组多年前从肾小球内皮细胞中克隆的TGF-β下调新型蛋白。TIMAP蛋白结构与肌球蛋白磷酸酶(Myosin Phosphatase,MYPT)靶向亚单位相似,含有与蛋白磷酸酶1催化亚基(PP1c)结合区域和五个锚定蛋白重复系列(Ankryn Repeats),C端含有CAAX盒,表明能够通过异戊二烯化表达于细胞膜,TGF-β如何下调TIMAP以及TIMAP是否参与TGF-β介导的细胞过程至今不明。TGF-β是机体最重要的细胞生长因子之一,能够影响多种细胞和组织的生理及病理过程,如胚胎发育,炎症,纤维化,肿瘤等。尽管TIMAP最先被发现高表达于内皮细胞,内皮细胞和血细胞具有同源性。本课题首次发现单核巨噬细胞高度表达TIMAP。单核巨噬细胞是显著受到TGF-β影响的专职炎症细胞,具有向促炎的M1表型和以组织修复为特征的M2表型转化的特征。在炎症性疾病早期,单核巨噬细胞被炎症趋化因子吸引到炎症区域并分泌大量促炎因子;炎症后期,单核巨噬细胞释放大量TGF-β并向M2表型转化,通过迁移和吞噬活动消除坏死组织和细胞,分泌大量纤维基质促进受损组织的修复和重建。但持续存在的组织损害因素往往导致过激的单核巨噬细胞反应和TGF-β活性,造成过度吞噬活动最终导致各种慢性疾病,比如组织纤维化,持续的炎症反应和癌症细胞转移。单核巨噬细胞的迁移和吞噬活动基于肌动蛋白和肌球蛋白多聚体收缩产生的细胞骨架和胞膜运动,其活性主要受肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化正调控。而MLC磷酸化水平受到肌球蛋白激酶MLCK和肌球蛋白磷酸酶MP控制。最近有体外实验研究表明TIMAP参与了 MP对MLC去磷酸化,说明MLC是TIMAP的潜在作用底物。但目前尚不清楚TIMAP是否能够通过对MLC去磷酸化作用而影响TGF-β介导的单核吞噬细胞组织修复活动。研究目的本文研究目的旨在:1)探究TGF-β下调TIMAP的分子生物学调控机理;2)TGF-β下调TIMAP对TGF-β介导的单核巨噬细胞M2极化及迁移/吞噬功能的影响;3)TIMAP是否在单核巨噬细胞中通过MLC去磷酸化而发挥调控作用。研究方法及结果在本课题的研究中,我们意外发现TIMAP除了在内皮细胞中富集,在单核吞噬细胞中也呈现高度表达。单核吞噬细胞中TIMAP表达水平可以被TGF-β下调,并被组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂逆转。TGF-β通常通过Smad信号通路调控下游基因表达。TIMAP启动子含有潜在的Smad结合元件。采用TIMAP启动子报告质粒,我们发现TGF-β可以抑制包含Smad结合元件(SBE)的TIMAP启动子转录活性,而HD AC抑制剂同样可以逆转TGF-β对TIMAP启动子活性的抑制。这些结果提示TGF-β下调TIMAP的调控过程有HDAC家族成员的参与。单核吞噬细胞受到TGF-β的刺激后,HDAC家族成员中只有HDAC3的蛋白表达水平表现出特异性增高。染色体免疫共沉淀实验显示,TGF-β能够诱导Smad2/3和HDAC3与TIMAP启动子区上的Smad结合元件位点区域结合,该区域上的组蛋白3乙酰化(Acetyl-Histone H3,Ac-H3)水平下降,表明TGF-β通过HDAC3相关的Smad经典信号通路下调TIMAP,在这个过程中HDAC3使TIMAP启动子区的组蛋白发生去乙酰化改变而使TIMAP基因的转录表达受到抑制。我们接着对TIMAP在TGF-β诱导的单核吞噬细胞M2的极化转化作用进行了研究,发现TIMAP能够抑制TGF-β诱导的巨噬细胞M2表型标志物精氨酸1(Arg-1)和白介素10(IL-10)的表达,提示TIMAP可以调节TGF-β相关的炎症反应和组织修复活动。在单核吞噬细胞内,TIMAP和MLC结合,并降低TGF-β诱发的MLC磷酸化改变,说明MLC是TIMAP的作用底物。我们接着检测了TIMAP调节MLC对单核吞噬细胞M2表型功能的影响,发现TIMAP的表达水平与TGF-β诱导的巨噬细胞的迁移和吞噬作用呈负相关,而MLC磷酸化在其中起到中介的关键作用。这些结果说明TIMAP调节MLC磷酸化是TGF-β诱导单核吞噬细胞M2极化转化的必要步骤。结论我们的研究揭示HDAC3介导的TIMAP下调以及对MLC磷酸化的调控是TGF-β通过单核细胞修复组织损伤过程中的重要调控元件。TGF-β通过HDAC3相关的Smad信号通路下调TIMAP,TIMAP负调节TGF-β诱导的巨噬细胞M2的极化,并且通过对MLC磷酸化的调控影响单核吞噬噬细胞M2表型相应的迁移和吞噬作用。异常活化的TGF-β是许多慢性疾病的发生发展的重要诱因,HDAC抑制剂以及干预TGF-β信号传导对小鼠组织纤维化,炎症相关疾病及肿瘤具有显著保护作用,由此推测,针对TIMAP调控通路的干预设计有可能改善TGF-β相关的临床慢性疾病过程。