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狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的重要人兽共患传染病,几乎所有的温血动物都易感。到目前为止,尚没有有效的狂犬病治疗方法,一旦出现临床症状,死亡率接近100%。人间狂犬病主要由犬传播而来,据世界卫生组织（WHO）统计,全球每年超过59000人死于狂犬病。联合国粮食及农业组织（FAO）、世界动物卫生组织（OIE）、全球狂犬病控制联盟（GARC）和世界卫生组织（WHO）等国际组织根据“同一个健康”理念建立了“联合抗击狂犬病”全球合作平台,呼吁全球在2030年前消除经犬传播的人狂犬病。疫苗免疫接种是预防狂犬病最为有效的手段,WHO研究表明70%以上的免疫覆盖率就可有效控制狂犬病的流行。目前,我国批准使用的狂犬病疫苗为灭活疫苗,具有安全性高的优点,但往往需要多次、高剂量免疫才能刺激机体产生有效保护。免疫佐剂作为疫苗的重要组成成分,能够诱导机体产生长期、高效的特异性免疫反应,提高疫苗保护力,同时又能减少免疫原的用量,降低疫苗生产成本。在新一代灭活疫苗的研制中,将抗原特异、持久的靶向运输至树突状细胞（DCs）,通过激活的DCs启动全身免疫应答是一种重要的研发策略。DCs靶向分子佐剂能有效提高DCs抗原摄取能力,促进DCs的激活,进而提升疫苗免疫效果。为进一步提高狂犬病灭活疫苗的免疫效果,本研究筛选了大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）和脓肿分枝杆菌效应因子（MAB2560）两种分子佐剂用于后续研究。首先,构建了表达LTB、MAB2560的重组表达质粒p ET30a（+）-LTB-8x His、p ET30a（+）-MAB2560-8x His,利用大肠杆菌表达系统成功表达了融合蛋白LTB-8x His和MAB2560-8x His。同时,对蛋白的表达与纯化条件进行优化,获得了较高纯度的LTB与MAB2560重组蛋白。利用纯化后的LTB与MAB2560重组蛋白分别免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并成功应用于LTB与MAB2560的Western Blot与IFA检测。基于狂犬病毒病毒反向遗传操作系统,将LTB、MAB2560基因插入到狂犬病病毒CVS11株基因组G-L之间,构建了嵌合表达LTB、MAB2560的重组全长质粒。将全长质粒与辅助质粒共同转染BSR细胞,拯救获得了表达LTB、MAB2560分子的重组狂犬病病毒r CVS11-LTB、r CVS11-MAB2560。利用RT-PCR、IFA、Confocal等方法对重组病毒进行鉴定,结果表明外源蛋白LTB、MAB2560可以正常表达并展示在病毒颗粒表面。分别以MOI=1、0.1接毒测定重组病毒在N2a、BSR细胞上的生长曲线,结果显示,重组病毒r CVS11-LTB、r CVS11-MAB2560与母本毒株CVS11具有相似的生长曲线,表明外源基因的插入不影响重组病毒的体外生长。病毒适应性传代结果显示,重组病毒r CVS11-LTB、r CVS11-MAB2560可在N2a细胞上高效而稳定的复制,滴度可达到10~8TCID50/m L-108.5TCID50/m L,同时,插入的外源蛋白LTB、MAB2560基因可以稳定传代15代,不会因为传代而丢失。为评价以上两种重组病毒是否可以作为狂犬病灭活疫苗的候选株,利用动物试验对其安全性和免疫原性进行了评价。将重组病毒与母本病毒以10~3TCID50/只的剂量通过脑内注射途径感染BALB/c小鼠（4-6周龄）,每天观察其临床症状、体重变化与存活情况。结果显示:重组病毒感染小鼠的临床症状与死亡率均低于母本病毒,表明重组病毒r CVS11-LTB、r CVS11-MAB2560对小鼠的致病性低于母本病毒CVS11。将重组病毒灭活后与Gel02佐剂混合制备疫苗,分别免疫小鼠和犬评价其细胞免疫和体液免疫情况。小鼠免疫试验结果显示:重组病毒r CVS11-LTB、r CVS11-MAB2560免疫后7天即可诱导机体产生抗狂犬病病毒中和抗体,免疫后14天血清中和抗体水平高于0.5IU/m L,且显著高于母本病毒免疫组,加强免疫后抗体效价显著提升,约为母本病毒的三倍。与母本病毒相比,重组病毒r CVS11-LTB、r CVS11-MAB2560可以在免疫初期促进并激活淋巴结中DCs、T细胞、B细胞的增殖。加强免疫后,重组病毒免疫组小鼠脾脏中B细胞的活化显著增强,分泌IFN-γ和IL-4的脾细胞、记忆性T细胞数量均显著增多。犬免疫试验结果表明:重组病毒r CVS11-LTB、r CVS11-MAB2560免疫2次后可刺激机体产生保护水平的中和抗体（＞0.5IU/m L）,且中和抗体水平显著高于母本病毒免疫组。综上所述,本研究利用狂犬病病毒反向遗传操作系统成功构建了表达LTB、MAB2560分子佐剂的重组狂犬病病毒,与母本病毒相比,重组病毒免疫动物后可刺激机体产生更高水平的体液免疫和细胞免疫应答,可作为狂犬病疫苗候选株。