背景和目的:乙肝病毒X（HBx）蛋白在乙肝病毒（HBV）致病过程中发挥重要作用,研究证实其不仅能够促进HBV的复制,还参与慢性肝炎及肝细胞癌（HCC）的形成。然而,HBx蛋白在HBV相关肝细胞损伤中的具体致病机制尚未完全明确。迄今为止多项研究证实HBx蛋白与肝细胞线粒体的相互作用是引起肝细胞损伤、调控细胞凋亡、并最终诱发肝癌形成的重要因素。前期研究中,我们通过多种方法证实HBx蛋白能够与线粒体细胞色素C氧化酶亚单位III（COXIII）相互作用,并引起线粒体功能损伤,从而改变肝细胞的多种生物学活动。本研究将以HBx蛋白与COXIII的相互作用为研究基础,探讨HBx蛋白诱发正常人肝细胞HL-7702细胞系线粒体通透性转化孔（Mitochondrial permeability transition pore,MPTP）开放的具体机制及其对线粒体及细胞功能的损害,并进一步观察氧化应激作用下,HBx蛋白对HL-7702细胞凋亡的影响。方法:首先构建含有HBx基因（ayw亚型）的真核表达载体,并在羧基端融合flag序列（HBx-flag）,建立编码HBV全基因组1.2倍体（payw1.2）的p GEM-HBV质粒及HBx置换突变的相同质粒p GEM-HBV-?HBx。将各组质粒瞬时转染正常肝细胞HL-7702,建立4个实验组:1、HL-7702/pc DNA3.1组;2、HL-7702/HBV组;3、HL-7702/HBV-?HBx组;4、HL-7702/HBx组。Western Blot分别检测flag及HBc Ag的表达,以监测各组质粒在HL-7702细胞中的表达情况。接着,通过酶动力学方法检测4组细胞线粒体细胞色素C氧化酶（COX）的活性,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位的变化,生物发光法检测4组细胞ATP水平变化。使用钙离子特异性染料Flou-4进行染色,在共聚焦显微镜观察MPTP特异性抑制剂环孢素A（Cs A）使用前后4组细胞胞浆钙离子水平的变化,检测HBx蛋白对MPTP的调控作用。随后予H₂O₂诱导细胞凋亡,并使用ROS特异性染料DCFH-DA对各实验组进行染色,共聚焦显微镜下观察H₂O₂处理前后四组细胞ROS水平。为进一步探究HBx蛋白在氧化应激诱导下对细胞凋亡的调控作用,我们使用Western Blot检测H₂O₂诱导下,Cs A预处理前后细胞总蛋白、线粒体蛋白及胞浆蛋白中促凋亡蛋白Bax含量的变化,共聚焦显微镜观察Bax蛋白在细胞内的分布变化。接着通过免疫荧光及Western Blot检测H₂O₂诱导下,Cs A预处理前后线粒体细胞色素C的释放情况。最后使用Western Blot检测H₂O₂诱导下,Cs A预处理前后凋亡蛋白cleaved-caspase3及cleaved-PARP表达水平,并使用流式细胞仪检测各处理组细胞凋亡水平的变化。结果:成功构建4组瞬时表达载体,并在HL-7702细胞中成功检测到各组质粒的表达;酶动力学法检测到HBx蛋白降低了HL-7702细胞中COX活性,进而减少细胞ATP水平,并下调线粒体膜潜能。共聚焦显微镜下观察到HBx蛋白引起HL-7702细胞胞浆钙离子超载,且HBx蛋白的这一作用能被MPTP特异性抑制剂Cs A抑制。另外,共聚焦显微镜下观察到HL-7702/HBx组细胞ROS水平较HL-7702/pc DNA3.1组未见明显变化,但HL-7702/HBV组较HL-7702/HBV-?HBx组细胞内ROS水平明显增高。然而,当暴露于H₂O₂时,HL-7702/HBx组与HL-7702/PGEM-HBV组均较对照组明显增高。在H₂O₂的刺激下,HBx蛋白并未影响凋亡蛋白Bax在细胞内的表达水平,但其改变了凋亡蛋白Bax在细胞内的分布,促进胞浆内的Bax蛋白减少,而线粒体Bax蛋白含量增加,HBx蛋白的这一作用能被Cs A所抑制。与此同时,H₂O₂的刺激下,HBx蛋白促进线粒体细胞色素C的释放,并上调HL-7702细胞内cleaved-caspase3及cleaved-PARP蛋白水平,进一步上调细胞凋亡水平。而抑制MPTP的开放则在一定程度上逆转了HBx蛋白的这一作用。结论:HBx蛋白本身或与HBV编码的其他蛋白共同存在的情况下,均能够损伤肝细胞线粒体功能,进而诱发MPTP开放,引起胞浆钙离子超载。但值得注意的是,HBx蛋白本身并不引起细胞内ROS水平的改变,但在H₂O₂的刺激或HBV其他蛋白同时存在的情况下,HBx蛋白表现出明显上调细胞内ROS的作用,证实了HBx蛋白本身并不引起明显的细胞损伤,但其能够增加HL-7702细胞对氧化应激刺激的敏感性,并改变凋亡蛋白Bax在细胞内的分布,促进细胞凋亡。通过抑制MPTP的开放能够明显下调HL-7702细胞对氧化应激刺激的敏感性,证实HBx蛋白的这一作用与其对MPTP的调控密切相关。