论文部分内容阅读
DNA磷硫修饰是迄今为止被发现的第一类发生在DNA骨架上的生理修饰，其是由dnd基因簇编码的DndA、DndB、DndC、DndD、DndE蛋白所调控。根据生物信息学分析，DndE蛋白可能是一类NCAIR合成酶的同源蛋白或者是一种PAPS硫转移酶的同源蛋白，这种功能推测上的模糊性为进一步开展DNA磷硫修饰的研究带来了巨大的困难。因此为了解决这一难点，准确阐述DndE蛋白的生理功能，我们选择DndE蛋白作为研究对象。为了研究DNA磷硫修饰在物种上的保守性和进化性，我们选择了来源于Streptomyceslividans66的DndE蛋白作为进一步的研究对象。 首先，我们摸索了Streptomyces lividans66 DndE蛋白的表达纯化条件，尝试了不同的载体和不同的表达标签，如pET-44b、pSJ7、pET-28a。最终发现当利用PSMT3载体进行异源表达与纯化的时候，最终可以获得比较稳定的DndEN-flag-livdan蛋白。在获得稳定的DndE蛋白样品以后，我们对其开展了一系列功能的研究。研究表明Streptomyces lividans66的DndE蛋白存在构象不均一，多聚现象等，且这种多聚与DndE蛋白的浓度有关系。 鉴于DndE蛋白多聚的现象，无法使用NMR技术进行结构的解析，于是我们尝试用X-ray的方法对DndE蛋白进行结晶学研究。在得到比较稳定的蛋白样品后，进行了一系列的结晶筛选和结晶优化，再进行晶体条件初筛的时候得到了一些DndE的晶体，随即对一些晶型比较好的晶体进行优化，可惜的是，由于没有达到晶体解析的分辨率，最终没有得到DndE的晶体结构。 根据最近的文献报道，发现在Escherichia coli B7A的DndE蛋白可能是一种骨架新颖的DNA结合蛋白。于是，我们也猜测Streptomyces lividans66的DndE蛋白是不是也有可能是一种DNA结合蛋白，为了验证这一点，我们设计了随机标记的荧光DNA双链小分子(fluorescence polarization，FP)对其开展研究，发现DndE蛋白和随机的DNA的双链有较强的结合，故推测DndE蛋白是一种与DNA有着非特异性结合的、新颖的DNA结合蛋白，在整个DNA硫修饰的机制中可能扮演一个传递的功能。