巨噬细胞是参与体内组织防御和稳态维持的一群重要的免疫细胞,一方面它可以利用吞噬作用来杀死和清除病原体、细胞碎片及损伤组织,另一方面它可以激发获得性免疫反应从而发挥进一步的功能。巨噬细胞具有异质性,在不同环境信号刺激下呈现不同表型和功能。目前根据参与的免疫应答反应将巨噬细胞分为经典活化的巨噬细胞(M1型)和替代性活化的巨噬细胞(M2型)。M1型巨噬细胞主要参与1型辅助T细胞(Th1)抗病原的免疫应答反应,可有效杀死病原菌和肿瘤细胞；而M2巨噬细胞抑制免疫反应和获得性免疫应答,参与血管生成、组织重排和修复等过程。肿瘤组织中的巨噬细胞[肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAM)]多呈现M2表型,它们并非发挥抗肿瘤作用,而是可以促进肿瘤发生、增值、入侵和转移等过程,并且与肿瘤组织中血管生成有密切关系。因此,研究M1型巨噬细胞在免疫中的作用以及M2巨噬细胞在肿瘤发展中的作用对理解异质的巨噬细胞的不同功能具有积极的意义。M1型巨噬细胞作为专业的吞噬细胞,在抗菌感染过程中发挥着重要的作用。在组织被病原感染之后,最先响应的巨噬细胞通常呈现出炎性表型并分泌大量的促炎分子。巨噬细胞的吞噬作用是动物进化中较保守的细胞生理活动,主要行使防御病原菌侵染宿主和起始获得性免疫应答的功能。Rab蛋白是细胞质中囊泡运输的分子开关,目前发现多种Rab蛋白参与吞噬过程。本实验室前期研究表明,在无脊椎动物对虾和果蝇中,Rab6蛋白通过直接与肌动蛋白互作来调控细胞吞噬作用,从而抵抗病毒的感染。但是,Rab6蛋白在哺乳动物吞噬作用中的功能尚不清楚。本论文以小鼠巨噬细胞RAW 264.7为研究对象,探索了小G蛋白Rab6在哺乳动物吞噬过程中的作用。研究结果显示,Rab6蛋白不直接影响巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的摄取,而是参与胞内吞噬小体的成熟过程。Rab6蛋白与其效应蛋白BICD1相互作用,调控巨噬细胞内吞噬小体成熟的中后期,这一作用机制与无脊椎动物不同。Rab6蛋白参与的吞噬作用对吞入的金黄色葡萄球菌在胞内的存活也有消极的影响。通过非活性和活性状态的转变以及与驱动蛋白复合物的相互作用,Rab6蛋白可以在时空上控制马达蛋白介导的运输过程和细胞内结构的融合过程。因此,本论文揭示了小G蛋白Rab6在调控哺乳动物巨噬细胞抗菌免疫中的重要作用。另一方面,我们研究了M2型巨噬细胞在肿瘤转移中的作用。在肿瘤组织中,除了肿瘤细胞之外还存在其他类型的细胞,包括成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞,这些细胞共同组成肿瘤微环境。肿瘤组织中最重要的免疫细胞是巨噬细胞,且多呈现M2表型。本论文中免疫组织化学染色结果显示,胃癌组织周围聚集大量的M2型巨噬细胞,说明肿瘤细胞将巨噬细胞招募至组织中,并诱导其分化为M2表型。TAM通过分泌细胞因子参与肿瘤发展的调控,但是目前关于巨噬细胞分泌蛋白在肿瘤发生中的作用研究仍然较少。本文的细胞试验和动物试验结果显示,M2型巨噬细胞大量分泌的几丁质酶3样蛋白1 (CHI3L1)具有促肿瘤转移的活性。通过GST下拉试验,我们寻找到与CHI3L1结合的肿瘤细胞膜上的受体——白介素13受体a2 (IL-13Rα2);细胞免疫荧光和免疫共沉淀试验证明了两者之间的直接互作。由此可知,CHI3L1蛋白通过与肿瘤细胞膜上的IL-13Rα2受体相互作用,进而促进肿瘤细胞的迁移、粘附和入侵,以达到促肿瘤转移的目的。研究结果显示,CHI3L1蛋白处理肿瘤细胞后,IL-13Rα2受体的激活触发细胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,引起细胞外调节蛋白激酶1和2(ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白磷酸化水平的升高,进而促进激活蛋白1(AP-1)家族转录因子在细胞核内的聚集。AP-1家族转录因子可以结合在基质金属蛋白酶(MMP)基因的启动子区域,从而促进MMP家族基因的转录。肿瘤细胞分泌的MMP可以有效降解基底膜和周围的胞外基质,使纤连蛋白暴露于肿瘤细胞之间,从而促进肿瘤细胞的粘附和转移。与此同时,动物试验结果表明CHI3L1蛋白具有促肿瘤转移的功能。因此,巨噬细胞中的CHI3L1蛋白可以作为肿瘤治疗的新靶点。我们采用免疫共沉淀与Western blot相结合的方法来检测入血清样品中CHI3L1蛋白的含量,结果显示,乳腺癌和胃癌病人血清中CHI3L1蛋白的含量较高,而正常人血清中CHI3L1蛋白检测不到。此前有研究报道,在乳腺癌和肺癌中,癌症病人血清中HER2和C反应蛋白的含量明显高于健康人,并可作为肿瘤诊断的标志物。由此可见,血清中的CHI3L1蛋白有望成为诊断乳腺癌和胃癌的标志蛋白。在了解了M2型巨噬细胞分泌的CHI3L1蛋白促肿瘤转移的作用机制后,我们以CHI3L1基因作为靶点,探索对虾microRNA (miRNA)在跨物种调控人类肿瘤转移中的作用。为了研究对虾miRNA能否跨物种调控人肿瘤的转移,我们在M2型巨噬细胞内过表达对虾miRNA,进而检测肿瘤细胞转移能力的变化。我们利用生物信息学软件预测了三条可能与人CHI3L1 mRNA 3’UTR(3’非编码区)相互作用的对虾特有的miRNA——mja-miR-35、mja-miR-36、mja-miR-37。细胞转染以及靶基因验证试验表明,对虾mja-miR-35可以直接作用于CHI3L1 mRNA 3’UTR,敲低巨噬细胞内CHI3L1基因的表达,并减少分泌到胞外的CHI3L1蛋白的含量,从而影响巨噬细胞对肿瘤细胞转移的促进作用。但是mja-miR-36和mja-miR-37并不能有效敲低CHI3L1基因的表达量。凝胶迁移阻滞试验显示,人AG02蛋白与这三条miRNA均能结合,说明AG02蛋白与miRNA的结合没有序列和物种选择性。我们推测mja-miR-36、mja-miR-37与AG02蛋白的结合可能改变了AG02蛋白的构象,从而抑制了AG02蛋白介导的靶基因降解过程。对虾作为重要的水产品之一,由于感染对虾白斑综合症病毒(WSSV)引起的对虾大量死亡是对虾养殖的难题。近几年研究发现,siRNA和miRNA参与对虾的抗病毒免疫。我们通过研究发现,对虾mja-miR-35可以作用于WSSV病毒基因,从而抑制病毒在对虾体内的复制及感染,促进对虾的抗病毒免疫。这些结果说明,对虾mja-miR-35既能调控对虾抗病毒免疫,又能跨物种调控人类肿瘤细胞的转移。本论文围绕巨噬细胞在抗菌免疫以及促进肿瘤转移中的功能展开研究。首先通过研究小G蛋白Rab6在哺乳动物M1型巨噬细胞吞噬过程中的作用,我们发现Rab6蛋白能调控吞噬小体的成熟过程。其次,我们阐明了肿瘤细胞可以招募M2型巨噬细胞以及M2型巨噬细胞大量分泌的CHI3L1蛋白进一步促进肿瘤转移的作用机制。因此,本文的研究结果对理解巨噬细胞在抗菌免疫以及肿瘤转移中的功能具有重要意义。最后,我们发现一条对虾miRNA——mja-miR-35,该miRNA既能调控对虾抗病毒免疫,又能跨物种调控人类肿瘤细胞的转移。