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猪呼吸道疾病综合征(porcinerespiratorydiseasecomplex，PRDC)是大、中型养猪生产业中临床表现为肺炎等呼吸系统症状的呼吸系统疾病的总称。PRDC是由一种或多种细菌、病毒、环境应激等诸多因素相互作用引起。其主要病因包括病原性因素和非病原性因素。病原性因素主要包括病毒感染，如猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-Ⅱ)等；细菌感染，如APP、HPS、PM、STR等；支原体感染，如猪肺炎支原体。HPS、APP、PM是PRDC的主要病原菌，为快速检测诊断和更有效防治这些主要病原菌感染，本项研究首先对广东和广西地区送检的临床肺脏等病料进行HPS的分离鉴定，并用PCR方法进一步确证。在HPS分离鉴定的基础上选择PRDC病因中的主要病原菌：副猪嗜血杆菌(HPS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪多杀性巴氏杆菌(PM)作为研究对象，在建立三者单项PCR诊断方法的基础上，建立HPS-APP-PM三联PCR诊断和鉴定方法，为PRDC的防治奠定基础。
1.从广东和广西地区养猪场送检的患呼吸道病疑似副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，Hps)感染的猪肺脏等20份病料中分离到3株可疑菌株。通过形态染色特性、生化反应、部分生物学特性等试验，初步鉴定为副猪嗜血杆菌。在细菌学鉴定基础上，参照相关的文献报道，引用3对引物，以三株参考菌株的DNA提取物为模板进行PCR扩增反应，作为细菌鉴定的进一步确认，结果3株分离菌株均成功扩增出预期约822bp、1.9kb和824bp大小的DNA片段。试验同时对3株分离菌株的16SrRNA基因的PCR产物进行克隆、测序和同源性比较，结果同源性均达到97.5％以上。试验选取HPSGS1株作为参考阳性菌株，提取其DNA，设计优化PCR扩增程序，并对PCR反应的特异性、敏感性等反应要素进行筛选，建立HPS16SrRNA基因PCR检测方法。经初步应用试验，所建立的PCR检测方法不仅可从初代分离培养物中对HPS进行诊断，而且可直接从病料中进行HPSPCR检测诊断。
2.参考文献报道，根据APPapxIVA毒素基因、PM相关基因、HPS16SrRNA基因的保守区和多联PCR扩增引物设计的要求，分别设计合成3对多联PCR引物。3种病原菌的PCR扩增基因片段大小分别为APP442bp，PM156bp，HPS822bp。在确立单项PCR特异性的基础上，通过相关的PCR程序设计，优化单项PCR检测的各项反应要素：引物浓度、退火温度、底物浓度、酶浓度等，建立3种病原菌的单项PCR检测方法。单项PCR检测方法的敏感性分别为HPS为65个菌；APP为82个菌；PM为78个。对扩增产物进一步进行核苷酸序列分析、比较，证明PCR扩增基因片段与PCR扩增设计片段相同。应用所建立的各病原菌的PCR方法和程序，对猪具呼吸道病症状的送检病料进行检测，配合临床症状、病理变化和流行病学，确立了APP和PM单项PCR检测方法应用的可行性，具有特异、敏感和实用价值。
3.在优化单项PCR检测方法的基础上，通过优化组合，确定引物浓度，建立了APP-HPS-PM多联PCR检测方法。应用建立的多联PCR方法，对37份临床上具有呼吸道病病变的病料的第一代分离混合菌DNA和直接提取的病料DNA进行检测，第一代分离混合菌检测结果为：HPS9/20、APP10/21、PM7/19，与单项PCR检出率(HPS9/20、APP11/21、PM7/19)相当；病料DNA检测结果为：HPS7/20、APP9/21、PM5/19，比单项PCR检出率(HPS8/20、APP11/21、PM6/19)低。比常规单项PCR诊断方法更省时、简便、节约诊断成本，具有简便、敏感、特异的检测猪呼吸道病综合症主要病原菌HPS、APP、PM的实用价值。