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目的:探索乙型肝炎病毒s W172*耐药突变型的致癌机制,初步探索防治由于核苷酸类抗病毒治疗引起HBV耐药性突变所致肝细胞癌的新思路。方法:1.以重组质粒p IRES2-pre-S/S(WT)为模板,设计孪生PCR引物得到pre-S/S片段以替换绿色荧光蛋白基因(EGFP)的方法插入p IRES2-EGFP中,以p IRES2-pre-S/St(s W172*)为模板,设计引物获得pre-S/St片段插入上述替换了EGFP的质粒中构建成为p IRES2-pre-S/St-pre-S/S(WT+s W172*)双基因共表达载体。2.Control,WT和s W172*质粒分别转染Hep G2细胞,外源性免疫共沉淀Co-IP检测WT和s W172*是否在Hep G2细胞内与KPNA2结合,半内源免疫共沉淀Co-IP检测KPNA2与大(LHBs),中(MHBs),小(SHBs)表面蛋白中哪一个结合。3.Control,WT,s W172*和WT+s W172*质粒分别转染Hep G2细胞,细胞免疫荧光双标定位:Alexa Flour 594标记HBs Ag,Alexa Flour 488标记KPNA2,DAPI标记细胞核。4.Control,WT,s W172*和WT+s W172*质粒分别转染Hep G2细胞,分别提取细胞核与细胞质蛋白,检测HBs Ag的表达并做比较。5.Control,WT,s W172*和WT+s W172*质粒分别转染Hep G2细胞,RT-q PCR和Western blot分别检测c-Myc mRNA和蛋白表达水平。6.0,1μM,5μM和10μM浓度Ivermectin分别作用Hep G2细胞2h后,转染s W172*质粒,RT-q PCR和Western Blot分别检测c-Myc m RNA和蛋白表达水平。7.0,1μM,5μM和10μM浓度Ivermectin分别作用Hep G2细胞2h后,转染s W172*质粒,分别提取细胞核与细胞质蛋白,检测HBs Ag的表达并做比较。结果:1.p IRES2-pre-S/St-pre-S/S双基因共表达载体分别用3组不同的酶酶切,1%琼脂糖凝胶电泳检测,条带位置与预想目的片段的大小吻合;测序结果符合实验要求。2.Control,WT和s W172*质粒分别转染Hep G2细胞,外源性免疫共沉淀Co-IP结果显示WT和s W172*都与KPNA2结合,半内源免疫共沉淀Co-IP结果显示WT和s W172*中只有SHBs与KPNA2结合。3.Control,WT,s W172*和WT+s W172*质粒分别转染Hep G2细胞,激光共聚焦实验显示,WT不入核,s W172*部分入核且与KPNA2有共定位现象,WT+s W172*组可能有WT和s W172*部分竞争入核现象。4.Control,WT,sW172*和WT+sW172*质粒分别转染HepG2细胞,核质分离实验显示,WT不入核,s W172*中SHBs入核,WT+s W172*组SHBs入核明显减少。5.Control,WT,s W172*和WT+s W172*质粒分别转染Hep G2细胞,WT+s W172*组c-Myc的m RNA和蛋白表达明显比s W172*组偏低。6.0,1μM,5μM和10μM浓度Ivermectin分别作用Hep G2细胞2h后,转染s W172*,Ivermectin未处理组的c-Myc m RNA和蛋白表达水平比处理组明显偏高。7.0,1μM,5μM和10μM浓度Ivermectin分别作用Hep G2细胞2h后,转染s W172*,核质分离实验显示处理组HBs Ag明显入核减少。结论:野生型与s W172*型HBs Ag竞争结合KPNA2下调c-Myc的表达