APC/CTE泛素连接酶介导MOC1的泛素化和降解的研究及水稻黄叶基因VYL的功能分析

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本文涉及两项研究课题内容,即MOC1的泛素化及降解的研究和水稻黄叶基因VYL的功能分析。  分枝发育是影响植物形态建成的重要因素之一,其发育过程受多个遗传途径的调控。本研究上篇以水稻稀穗少分蘖突变体moc1-5(MONOCULM1-5)和多分蘖突变体te(TillerEnhancer)为研究材料,通过对其相互作用机制的研究,发现APC/CTE复合体能够介导MOC1的泛素化,导致MOC1进入26S蛋白酶体进行降解,从而揭示水稻分枝(蘖)调控的一个新机制。主要研究结果如下:  1.和野生型相比,moc1-5突变体的小穗的一次枝梗、二次枝梗及小花数显著减少,分蘖数明显减少。此外,moc1-5突变体育性极差。  2.遗传分析显示moc1-5是单基因隐性突变体;采用图位克隆的方法将目标基因定位在6号染色体上约12Kb区间内,包含1个开放阅读框,即LOC_Os06g40780(MOC1)基因。突变体基因MOC1-5从ATG起第38位的C核苷酸缺失引起基因移码突变并导致蛋白翻译提前终止,致使其功能缺失。Westernblot实验证明moc1-5突变体中缺失MOC1蛋白。  3.序列分析发现MOC1蛋白N端有一个典型的D-box结构域。经酵母双杂交、体外pull-down实验证明,TE和MOC1之间存在依赖于D-box之间的互作。MOC1蛋白在te突变体中明显积累;体外实验表明,te突变体不能泛素化和降解MOC1蛋白;moc1-5/te双突变体的表型表明,TE作用于MOC1的上游。  叶绿体是植物进行光合作用主要场所。叶绿体中包含约3000种蛋白质,保证这些蛋白的内平衡是叶绿体发育和维持正常功能所必须的。本研究下篇以水稻转绿型黄叶突变体vyl(virescentyellowleaf)为材料,在已经获得候选基因的基础上,我们对该基因的功能进行了深入的研究,揭示了VYL蛋白在水稻叶绿体生物合成中的重要作用以及Clp蛋白复合体亚基间的互作关系。主要研究结果如下:  1.水稻叶色突变体vyl是发育阶段依赖型的黄化突变体。突变体整个生育期表现为,新生叶片为白化表型,之后自顶端向下逐渐转绿。叶绿体含量测定、超微结构观察、光合作用参数测定和叶绿体生物合成相关基因qRT-PCR检测均表明,突变体的叶绿体正常生物合成受到了影响。  2.突变的VYL蛋白保留了叶绿体定位信号和部分S14_ClpP_2结构域,但缺失了保守的Ser-His-Asp三联体的催化位点以及多肽结合位点。通过基因组互补、过表达、microRNAi干扰等实验证实了LOC_Os03g29810为目标VYL基因。  3.VYL-GFP融合蛋白以点状形式定位于水稻原生质体的叶绿体中;qRT-PCR和GUS活性检测结果表明:VYL在根、茎、叶、叶鞘、穗中均能表达;叶绿体发育的早期表达量最高;VYL基因的表达量与光介导的叶绿体发育进程相关。  4.进化树分析表明,VYL是拟南芥Clp蛋白酶亚基ClpP6在水稻中的同源蛋白。互作分析表明:VYL与Clp蛋白酶亚基OsClpP3和OsClpP4分别互作,突变体中VYL蛋白与OsClpP3、OsClpP4互作强度减弱。此外,OsClpP3还能和OsClpPT互作,OsClpP4也能和OsClp5、OsClpT分别互作。OsClpT和OsClpP4能够自身互作。OsClpP3-GFP、OsClpP4-GFP融合蛋白也呈点状定位于水稻原生质体的叶绿体中。qRT-PCR结果表明OsClpP3、OsClpP4、OsClp5、OsClpT具有和VYL同样的表达方式,在突变体中表达量上调。这些结果表明,VYL是叶绿体Clp蛋白酶的亚基之一。
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