鸡传染性法氏囊病(IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(infectiousbursaldiseasevirus)引起，是危害鸡的一种急性、高度接触性传染病。近年世界各地出现了超强毒IBDV(vvIBDV)，它的毒力远大于经典毒株，但是这种毒力增强的分子基础尚不完全清楚。IBDV基因组包括A节段和B节段，A节段编码所有的结构蛋白VP2、VP3、VP4和非结构蛋白VP5，B节段编码RNA聚合酶。VP2是主要的宿主保护性抗原，并与病毒毒力和细胞的嗜性密切相关，其毒力相关的控制位点主要位于VP2高变区的253、284位的氨基酸。但不同毒株的VP2高变区对毒力控制的表现有较大的差别，有的毒株毒力不由VP2高变区控制，说明还有别的区域控制。VP3是群特异性抗原，具有一定的免疫保护性，其羧基端与毒力有关，但是在不同的毒株表现怎样尚不得知。为探讨VP2高变区和VP3对IBDV毒力的影响，本文采用融合PCR，将超强毒Harbin-1的A节段和B节段各自的编码区(CR)和非编码区(NCR)进行连接，得到全长的基因组。同时，为了转录的需要，在5′端引入T7启动子序列，连入载体pMD-18-T-simple，得到的A节段克隆命名为pMD-18-HA(RHA)，B节段的克隆为pMD-18-HB(RHB)。在此基础上运用点突变将VP2高变区的253、284氨基酸位点同时突变，而对VP3的783、862、921氨基酸位点进行两点突变的组合，共得到4个含有双点突变组合的A节段。采用cRNA介导的反向遗传技术将A节段和B节段共转染法氏囊原代细胞(CEB)，用AC-ELISA筛选出4个突变的病毒，H253/284、H783/862、H862/921、H921/783通过CEF细胞培养实验和免疫荧光检测说明253、284突变未能改变细胞的嗜性，而783、862、921突变却都能改变细胞的嗜性，说明控制细胞的嗜性除由VP2控制外还有VP3。然后用相同滴度的病毒接种四周龄SPF鸡，测定其毒力，结果发现4个突变病毒对SPF鸡致死率和法氏囊病理变化有较大的差异。H921/783病毒组毒力最低，它不致死鸡，法氏囊病理变化也最轻微，仅间质增宽；H862/921、H253/284病毒毒力次之；H783/862病毒毒力较强，SPF鸡致死率高达5/8，法氏囊坏死并严重萎缩。以上结果表明，VP2高变区253、284和VP3的862、921氨基酸位点是毒力控制的决定因素，但是VP3控制毒力的能力强于VP2高变区。 另一方面，为了进一步说明超强毒株毒力增强和非编码区的关系，运用PCR法将Harbin-1的A节段5’非编码区(NCR)进行顺式缺失和以及和弱毒Cj801之间NCR的替换，得到缺失35(启动子区)、74(启动子和IRES区)、94(IRES区)碱基的突变体和嵌合体(CA)，再次运用采用cRNA介导的反向遗传技术转染法氏囊原代细胞，用AC-ELISA法筛选出4个突变的病毒，分别命名为H△35、H△74、H△94、Hca，并通过免疫荧光得到了验证。随后用流式细胞计数仪进行重组病毒对CEB细胞凋亡的研究。结果表明，重组病毒均能诱导原代法氏囊细胞(CEB)的凋亡，随着缺失长度的增加，病毒诱导细胞凋亡的能力也随之减弱(缺失74碱基的例外)，非编码区替换的病毒和野生病毒诱导细胞凋亡的能力没有差别。以上结果表明，Harbin-1的A节段5，NCR的启动子区和IRES区有增强细胞调亡的能力，启动子区和IRES区之间的区域可抑制细胞凋亡。 为了检测以上各个重组病毒的病毒复制速率，进行了定量PCR检测病毒复制，结果表明①5’NCR缺失和替换的重组病毒复制速率低于野生毒株，非编码区完整的病毒(CA)复制速率大于缺失的病毒。②各点突变病毒的复制速率以H921/783病毒的复制速率最高，H253/284最低；各个突变病毒的复制速率远低于野生毒株。