【摘 要】
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SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier-1)是由100个左右氨基酸组成的保守多肽家族成员,目前仅发现于真核生物中。SUMO作为融合标签和分子伴侣用于重组蛋的表达可明显提高其稳
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SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier-1)是由100个左右氨基酸组成的保守多肽家族成员,目前仅发现于真核生物中。SUMO作为融合标签和分子伴侣用于重组蛋的表达可明显提高其稳定性和可溶性,结合SUMO蛋白酶(ULP1)可以有效切除SUMO标签,释放的目的蛋白无多余氨基酸,因此不会影响目的蛋白的活性。类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide, ELP)是由VPGXG五肽重复序列构成的人工合成蛋白分子,具有温度诱导可逆相变特性,因此以ELP和SUMO/ULP1为融合标签构建的表达系统不仅可增加目的蛋白的可溶性,而且可借助离心等简单方法进行融合蛋白分离,在利用ULP1酶活性切割和释放目的蛋白,使生产成本大大降低。为了证明上述表达系统在重组蛋白表达与纯化方面的可行性,本研究以毕赤酵母基因组为模板分别扩增出SUMO序列及ULP1活性区编码序列,经测序证明正确后,分别插入含ELP编码序列的原核表达载体,获得融合表达载体pET-ELP-SUMO和pET-ELP-ULP1。以含犬α干扰素cDNA的重组质粒pET-EI-CalFN为模板,将PCR扩增出产物插入pET-ELP-SUMO载体,构建得融合表达载体pET-ELP-SUMO-CaIFN。用IPTG诱导重组菌表达,SDS-PAGE检测结果显示重组菌裂解物中能检测到预期的74Kd融合蛋白。利用ELP的温度诱导相变特性,通过在不同温度下反复离心获得了纯度较高的融合蛋白,产量约为15-18mg/L。再利用ULP1的裂解活性,将ELP-SUMO-CaIFN融合蛋白与ELP-ULP1融合蛋白共孵育,检测结果显示能释放出CaIFN目的蛋白。这些试验结果显示,本研究从毕赤酵母克隆的SUMO和ULP1序列能表达具有活性的蛋白,构建的自裂解SUMO/ULP1系统可用于重组蛋白表达与分离纯化。
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