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人参皂苷代谢物K(Ginsenoside metabolite compound K,CK)是原人参二醇型皂苷在人肠道内的主要代谢产物。研究表明,人参皂苷的药理活性主要是通过其代谢组分CK介导的,并且CK具有多种药理活性,如抗炎、抗肿瘤、抗过敏、抗糖尿病、保肝、神经保护、心血管保护等。课题组前期研究发现CK在佐剂诱导的关节炎(adjuvant-induced arthritis,AA)和胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)的动物模型中发挥免疫调节和抗关节炎作用。CK可降低全身评分、减少肿胀关节数量、降低关节炎指数和足爪肿胀;减轻CIA小鼠和AA大鼠的脾脏和关节病理学改变。CK的抗关节炎作用与免疫调节活性有关,CK对T、B、树突细胞和巨噬细胞的异常活化有抑制作用。CK还具有关节保护作用,抑制FLS的分泌和增殖功能,减轻关节损伤包括炎症浸润、关节软骨侵蚀和血管翳形成。另外,CK还具有抑制血管新生的作用,CK可以抑制异常血管平滑肌细胞的增殖和迁移,抑制人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和成管。然而CK是否具有直接的抗炎镇痛作用仍不清楚。本研究在前期研究的基础上,通过二甲苯诱导的耳肿胀模型、角叉菜胶诱导的炎症模型来评价CK的直接抗炎作用;使用热板实验、醋酸诱导的扭体实验以及角叉菜胶诱导的炎症性疼痛模型来评价CK的镇痛作用,通过检测前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2),环氧酶-1(cyclooxygenase,COX-1)和COX-2的水平探讨其可能的机制。目的:明确CK对急性炎症的抗炎镇痛作用及其可能的机制。方法:1.二甲苯诱导的耳肿胀模型和角叉菜胶诱导的大鼠足爪肿胀用于评价CK对急性炎症的的抗炎作用。昆明种小鼠以CK(7、14、28、56、112、224mg/kg),阳性对照药塞来昔布(28mg/kg),连续灌胃给药5天,末次给药1小时后,以二甲苯诱导耳肿胀模型,计算各用药组对肿胀的抑制率。SD大鼠以CK(5、10、20、40、80、160mg/kg),阳性对照药塞来昔布(20mg/kg),连续灌胃给药5天,末次给药1小时后,每鼠右侧足爪皮下注射1%的角叉菜胶0.1ml致炎。致炎后每间隔1小时测量一次足爪容积,以致炎前后足爪容积的差值计算肿胀度,并算出各用药组对肿胀的抑制率。2.采用热板实验、醋酸诱导的扭体实验以及角叉菜胶诱导的炎症性疼痛模型来评价CK的镇痛作用。昆明种小鼠以CK(7、14、28、56、112、224mg/kg)连续灌胃给药5 d,阳性对照药舒芬太尼(40μg/kg)皮下注射,末次给药后1小时,测定热板反应潜伏期,以此来评价CK的镇痛作用。昆明种小鼠以CK(7、14、28、56、112、224mg/kg),阳性对照药塞来昔布(28mg/kg)连续灌胃给药5d,末次给药1h后,每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.4ml,5分钟后观察并记录5分钟内小鼠的扭体次数,计算受试药物对小鼠扭体的抑制率,以此来评价CK的镇痛作用。SD大鼠以CK(5、10、20、40、80、160mg/kg),阳性对照药塞来昔布(20mg/kg),连续灌胃给药5天,末次给药1小时后,每鼠右侧足爪皮下注射1%的角叉菜胶0.1ml致炎。分别在足底注射角叉菜胶1、2、3、4、5和6小时通过使用机械伤害性刺激测量疼痛阈值。测试动物给予药物前后足爪伸缩反应的测量值(g)作为痛阈值。3.采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测角叉菜胶诱导的大鼠肿胀足爪以及胃黏膜组织中PGE2水平,ELISA和蛋白质印迹(western blot)检测角叉菜胶诱导的大鼠肿胀足爪以及胃黏膜组织中COX-1和COX-2的表达;体外CK(10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)作用于大鼠腹腔巨噬细胞,分别通过测定6-酮-PGF1α以及PGE2的产生来评估CK对COX-1活性以及COX-2活性的影响。结果:1.CK具有直接抗炎作用,可以减轻二甲苯诱导的耳肿胀和角叉菜胶诱导的足爪肿胀与正常组相比,二甲苯诱导小鼠左耳出现红肿。与模型组相比,CK(7、14、28、56、112、224mg/kg)以及塞来昔布(28mg/kg)明显减轻二甲苯诱导的小鼠耳肿胀,随着CK剂量的增加,其对耳肿胀的抑制作用逐渐增强,当剂量增加到224mg/kg时,其抑制作用基本达到最大效能(抑制率为93.9%)。使用角叉菜胶诱导的大鼠足爪水肿体内试验来评价CK急性抗炎活性,使用塞来昔布作为参比药物。与正常组相比,角叉菜胶皮内注射后1小时大鼠足爪开始出现肿胀,于4小时左右达高峰,后开始缓解。与正常组相比,致炎1小时时的各组大鼠足爪肿胀度无统计学差异,致炎2、3、4、5、6小时时CK(80,160mg/kg)和塞来昔布(20mg/kg)可以减轻足爪肿胀,4、5、6小时时CK(40,80,160mg/kg)可以减轻足爪肿胀。2.CK具有外周镇痛作用,可以减少醋酸引起的扭体次数、提高角叉菜胶诱导的炎性疼痛的痛阈。用热板法评价CK的中枢镇痛活性。与对照组相比,CK(7、14、28、56、112、224mg/kg)对热板引起的小鼠的痛阈没有影响,而舒芬太尼(40μg/kg)组小鼠的痛阈明显提高,说明CK对热板引起的疼痛没有镇痛作用。采用醋酸诱发的扭体法评价CK的外周镇痛作用。小鼠腹腔注射0.6%醋酸5min左右出现明显的扭体动作。与模型组相比,CK(224mg/kg)和塞来昔布(28mg/kg)可以明显减少醋酸引起的小鼠扭体次数(P<0.01)。角叉菜胶诱导的炎性疼痛用于评价CK对机械性刺激引起的疼痛的镇痛作用。与正常组相比,角叉菜胶皮内注射致炎后2小时,大鼠的痛阈明显降低,4小时后出现缓解,痛阈缓慢提高。与模型组相比,CK(40、80、160mg/kg)和塞来昔布(20mg/kg)在致炎后的第3、4、5、6小时明显提高大鼠痛阈值。3.CK的抗炎、镇痛作用与减少COX-2的表达、降低PGE2水平有关角叉菜胶诱导的大鼠足爪肿胀模型中,与正常组相比,模型组大鼠肿胀的足爪中PGE2水平增高,CK(10、20、40、80、160mg/kg)可以降低大鼠肿胀的足爪中PGE2的水平;模型组大鼠胃黏膜组织中PGE2的水平没有变化,CK对大鼠胃黏膜组织中PGE2的水平没有影响。与正常组相比,模型组大鼠肿胀的足爪以及胃黏膜组织中COX-2的表达水平增高,CK(20、40、80、160mg/kg)可以降低COX-2的表达水平;与正常组相比,模型组大鼠肿胀足爪中以及胃黏膜中COX-1的表达没有变化,CK对COX-1的表达没有影响。正常大鼠腹腔巨噬细胞以CK(10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)作用后,6-酮-PGF1α的产生没有变化,提示对CK对COX-1的活性没有影响。阻断COX-1的组成性表达后,LPS(1μg/ml)刺激大鼠腹腔巨噬细胞20h后PGE2的表达增高,CK(10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)作用后,对大鼠腹腔巨噬细胞PGE2的产生没有影响,提示CK对COX-2的活性没有影响。结论:(1)CK可以减轻二甲苯诱导的小鼠耳肿胀、减轻角叉菜胶诱导的大鼠足爪肿胀,提示CK对急性炎症具有抗炎作用。(2)CK可减少醋酸诱导的小鼠扭体次数、明显提高角叉菜胶引起的大鼠炎性疼痛的痛阈值,而对热板所致疼痛没有镇痛作用,提示CK具有外周镇痛作用。(3)CK可以降低角叉菜胶诱导的大鼠肿胀足爪中的PGE2水平以及COX-2的表达,但对COX-1的表达没有影响。提示CK的抗炎镇痛作用可能与减少COX-2的表达,降低PGE2水平有关。