背景:中医药治疗脑中风在中国历史悠久,有较好的临床疗效,地黄是中医治疗脑中风的重要药物之一。既往研究提示,地黄的主要有效成分梓醇具有对脑缺血后神经元的保护作用,但是对于脑卒中后“神经血管单元”是否具有整体保护效果尚不得而知。观察梓醇在脑缺血后对神经元和血管内皮细胞是否同时具有影响,研究梓醇对脑卒中后神经、血管的保护及其修复作用非常必要。目的(1)观察梓醇对人脐静脉血管内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells ,HUVECs)细胞黏附、增殖、迁移等行为的影响,观测其对大鼠原代皮质神经元存活以及轴突生长的作用,了解梓醇对HUVECs细胞表达红细胞生成素(erythropoietin,EPO)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的影响,从细胞生物学角度验证梓醇是否能诱导血管内皮细胞和神经元生长,并探讨其可能机制;(2)观察脑缺血大鼠神经行为学变化及梓醇的影响,考察梓醇对脑缺血动物模型的主要药效学结果;(3)观察梓醇对脑缺血后血管新生和神经元轴突芽生的作用,了解梓醇对脑缺血后GAP-43、VEGF和EPO蛋白表达的影响,从脑缺血后血管新生和轴突芽生角度研究梓醇对脑缺血的治疗作用,并从神经、血管生长促进因子层面探讨其作用机制;(4)初步了解转录因子STAT3在脑缺血后血管新生中的作用,观察梓醇对脑缺血后STAT3磷酸化水平的影响,进一步从基因(vegf)转录调控水平探讨梓醇促脑缺血后血管新生作用的机制。方法(1)培养脐静脉血管内皮细胞株和大鼠原代皮质神经元,采用细胞计数、MTT法、划痕实验等检测内皮细胞黏附率、增殖能力和迁移距离;培养大鼠原代皮质神经元,采用MTT法和测微尺测定神经元生存活力和轴突长度;采用免疫酶组织化学染色,原位检测HUVECs细胞EPO和VEGF蛋白表达;(2)制备局灶永久性脑缺血大鼠模型,于造模后6h、24h两个时点开始腹腔注射给予低、中、高剂量(1、5、10 mg?kg-1体重)梓醇进行治疗,连续7天,分别于造模后1、4、7、15、21天,进行Bederson神经功能评分、肌力评定、平衡木行走试验、受累前肢食物抓取成功率测试,从神经行为学角度评价梓醇治疗脑缺血的药效、有效给药时间窗及有效剂量;采用高效液相色谱技术,定性检测梓醇能否通过血脑屏障;(3)采用荧光单/双标记以及免疫酶组化染色,检测微血管密度和新生微血管数目,以及神经元轴突芽生分子标志GAP-43表达变化,评价梓醇对脑缺血后血管新生和神经元轴突芽生是否有促进作用;(4)采用神经超微病理技术,观察梓醇对脑微血管内皮细胞、神经元超微结构的影响;(5)采用免疫组化和Western blot免疫印迹分析法,原位检测和半定量分析各实验组脑组织内EPO和VEGF蛋白表达的变化;(6)使用AG490抑制STAT3磷酸化,采用免疫酶组化染色和荧光双标技术观察STAT3核转位现象和血管新生的变化,采用Western blot分析了解STAT3磷酸化水平和VEGF蛋白表达变化。结果一、离体实验结果1.梓醇促进HUVECs细胞黏附、增殖和迁移梓醇终浓度为0.25、0.5、1.0、2.5、5.0mg?ml-1时,与空白对照组相应时点比较可明显增强HUVECs黏附(P<0.05)。当梓醇终浓度为0.25mg?ml-1时,表现出时间依赖性地促进HUVECs黏附效应。梓醇终浓度为0.5、1mg?ml-1时可明显促进HUVECs增殖(P<0.05),终浓度为1mg?ml-1时HUVECs增殖率高达14%,明显高于空白对照组和其它剂量实验组(P<0.05)。但梓醇终浓度低至0.25mg?ml-1或高至2.5mg?ml-1时则出现增殖抑制效应。梓醇终浓度在0.5~5mg?ml-1范围时,可明显促进HUVECs细胞迁移(p<0.05)。划痕后24h和48h,终浓度1mg?ml-1梓醇组HUVECs细胞迁移距离分别达到102±27.6μm和142±35.5μm,与对照组差异具有显著性(p<0.01);而5mg?ml-1组24h和48h时迁移距离分别为42.85±12.09μm、74.5±24.8μm,呈现下降趋势,接近生理盐水组水平(p>0.05)。2.梓醇上调HUVECs细胞表达EPO和VEGF蛋白梓醇终浓度为0.5、1、2.5mg?ml-1时,梓醇组EPO阳性细胞光密度值均明显高于空白对照组和生理盐水对照组(P<0.05),提示梓醇可上调EPO蛋白表达,且呈浓度依赖性增加趋势。梓醇终浓度为0.5、1、2.5、5mg?ml-1时,梓醇组VEGF阳性细胞光密度值明显高于空白对照组和生理盐水对照组(P<0.05),提示梓醇对HUVECs细胞表达VEGF有上调作用(P<0.05)。3.梓醇促进原代培养的皮质神经元轴突生长原代培养并采用NF-200抗原鉴定神经元,纯度达95%以上。梓醇终浓度为1、2.5和5 mg·ml-1时,可明显促进神经元轴突延伸(P<0.05)。其中,梓醇终浓度为2.5 mg·ml-1时对神经元轴突生长的促进作用最强,显著高于空白对照组、阳性药物胞磷胆碱组和梓醇其它剂量组(P<0.05);梓醇浓度增至5 mg·ml-1时,其促进作用较2.5 mg·ml-1浓度组减弱,但无统计学意义(p>0.05)。MTT法检测结果显示,梓醇对神经元生存活性无明显影响。二、在体实验结果1.梓醇促进脑缺血大鼠神经缺失功能恢复采用Bederson神经功能评分、肌力评定、平衡木行走试验和左前肢食物抓取功能测定等多种方法评定脑缺血后1、4、7、15和21天各实验组神经缺失功能恢复状况,证实梓醇对脑缺血后功能恢复有促进作用。在脑缺血后21天,梓醇中、高剂量组受累前肢(左)食物抓取成功率分别为48.7%±5.4%(约相当于基线值72%)和47.3%±4.8%(约相当于基线值70%),与模型组(25.8%±4.1%,约相当于基线值38%)比较差异具有显著性(P<0.05)。提示梓醇对脑缺血后感觉运动功能恢复有促进作用。且脑缺血后21天时,术后6h开始给药组和术后24h开始给药组左前肢食物抓取成功率差异无显著性(P>0.05),提示脑缺血后延迟给予梓醇治疗仍对大鼠功能恢复有促进作用。2.梓醇能够通过血脑屏障给药后40min的大鼠脑脊液,HPLC法检测分析发现在保留时间为10.4min处可见梓醇的紫外吸收峰,与脑脊液加样对照梓醇的紫外吸收峰保留时间相同,表明给药后梓醇分布到大鼠脑脊液中。3.梓醇促进脑缺血后血管新生(1)大脑整体标本表面血管像特征脑缺血后15天,模型组可见边沿清晰的脑组织液化、坏死灶,脑表面血管分枝数目稀少,排列紊乱。而梓醇治疗组病灶基本愈合,脑表面血管分枝数目比模型组明显增加,大部分分枝跨越病灶表面,呈辐射状排列向病灶部位聚集。(2)激光共聚焦显示缺血周围区新生血管免疫荧光双标共定位图像显示,新生血管呈腊肠样结构,部分可见分枝。部分新生血管之间靠拢形成连接。模型组缺血灶周围大脑皮质可见管腔大、管壁薄的血管生成。新生的小血管向缺血病灶区辐射状移行长入,但分枝数目较少。梓醇组新生血管管腔比模型组小,分枝点增多。共定位位点数目统计结果分析显示:模型组、生理盐水组分别为40.67±2.30和34±3.25,均比假手术组明显增加(P<0.05);提示脑缺血后15天缺血周围区存在血管新生反应。梓醇中剂量组共定位位点数目达233.67±89.51,比模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组明显增多(P<0.05);进一步测定共定位区域累积光密度(IOD)值,结果与共定位位点数目结果一致。提示梓醇对脑缺血后血管新生确有促进作用。(3)脑微血管内皮细胞超微结构变化特征模型组缺血侧微血管内皮细胞胞质以及毛细血管周围高度水肿,电子密度浅,血管内皮细胞内线粒体数目减少,线粒体的大部分嵴融合消失,部分核膜融合消失。梓醇中剂量组和胞磷胆碱组:镜下表现较模型组均有明显改善,毛细血管周围水肿较模型组轻,基膜基本正常,血管内皮细胞可见较多的线粒体,已接近正常状态。初步印象以梓醇中剂量组对内皮水肿改善最为显著。4.梓醇对脑缺血后神经元轴突生长和突触超微结构的影响(1)梓醇对脑缺血后轴突生长标志物GAP-43蛋白表达的影响免疫荧光组化染色显示,脑缺血后15天,模型组和生理盐水组GAP-43阳性细胞积分光密度值分别为162.25±12.33和141.98±10.94,与假手术组127.45±3.7相比较,差异无显著性(P>0.05)。梓醇中剂量治疗组(5mg?kg-1)累积光密度值为359.24±12.38,较模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组增加,差异具有显著性(P<0.05)。Western Blot半定量分析与免疫荧光原位检测结果相符。提示梓醇可明显上调缺血周围区大脑皮质GAP-43蛋白表达。(2)梓醇对神经元突触超微结构的影响模型组缺血侧水肿重,突触前、后膜薄,溶解,突触后结构肿胀明显,电子密度浅,突触数目减少;梓醇组突触数目较模型组明显增多,突触后膜电子密度接近正常,突触病变较轻。5.梓醇对脑缺血后EPO蛋白表达的影响免疫组化结果显示,脑缺血后15天,模型组和生理盐水对照组阳性细胞累积光密度值分别为4.80±0.41和5.02±0.60,均明显高于假手术组(P<0.05),提示脑缺血后缺血灶周围残存大脑皮质EPO表达上调。梓醇中剂量组累积光密度值为9.43±1.27,显著高于模型组、生理盐水对照组和胞磷胆碱组,差异具有显著性(P<0.05);Western Blot半定量分析结果与EPO原位检测结果相符。提示梓醇对脑缺血后EPO表达有明显上调作用。6.梓醇对脑缺血后VEGF蛋白表达的影响模型组阳性细胞累积光密度值为325.10±26.82,比假手术组增加,差异具有显著性(P<0.05),提示脑缺血后VEGF的表达水平上调;梓醇组累积光密度值比其它实验组均明显增加,且差异具有显著性(P<0.05);Western blot半定量分析结果与上述结果一致。提示梓醇对脑缺血后VEGF蛋白表达有明显上调作用。7.梓醇对脑缺血后KDR蛋白表达的影响假手术组阳性细胞平均累积光密度值为47.95±5.78,而模型组为69.99±6.59,显著高于假手术组(P<0.05),提示脑缺血后KDR表达上调。梓醇组阳性细胞平均累积光密度值为116.3±10.23,比模型组和胞二磷胆碱组均明显增加(P<0.05);Western blot分析也显示,梓醇组相对IOD值比其它实验组均明显增高(P<0.05),与组化结果一致。提示梓醇对脑缺血后KDR蛋白表达有明显上调作用。8. STAT3信号在脑缺血后血管新生中的作用及梓醇对其影响(1)磷酸化-STAT3蛋白表达原位检测结果免疫组化显微图像分析显示,模型组p-STAT3阳性细胞累积光密度值(IOD)较假手术组明显增加(P<0.05),AG490(STAT3磷酸化抑制剂)组p-STAT3阳性细胞IOD值为12.8±1.5,明显比模型组42.38±2.55低(P<0.05),AG490与梓醇联合干预后,阳性细胞IOD值为56.22±4.25,比AG490组明显增加(P<0.05);且梓醇组IOD值为86.89±5.32,明显高于与模型组(P<0.05),提示梓醇可以促进脑缺血后STAT3磷酸化,部分抵消AG490对STAT3磷酸化的抑制作用。Western blot检测各组磷酸化STAT3蛋白表达与组化结果一致。(2) STAT3蛋白磷酸化率比较结果各实验组磷酸化STAT3与总STAT3蛋白条带IOD值的比值经内参β-actin校正后反映各组STAT3蛋白磷酸化率(p- STAT3/t- STAT3)。结果显示,假手组STAT3蛋白磷酸化率为8%,模型组为19%,差异具有显著性(P<0.05);AG490组为7%,明显低于模型组(P<0.05);AG490+梓醇组为16%,梓醇组为23%,比其他各实验组均高(P<0.05)。说明梓醇能明显提高STAT3蛋白磷酸化水平,部分抵消AG490对STAT3蛋白磷酸化的抑制作用。(3) VEGF蛋白表达水平比较结果免疫荧光图像分析结果显示,梓醇组IOD值明显高于模型组(P<0.05),联合使用梓醇和AG490干预后,VEGF表达水平较单用AG490组升高,梓醇部分抵消了AG490对VEGF蛋白表达的抑制效应。Western blot检测结果与此一致。(4)新生微血管相关参数比较结果IPP图像分析软件分析共定位图像,结果显示脑缺血后使用STAT3磷酸化抑制剂AG490,新生脑微血管参数即共定位位点数目和IOD值明显低于模型组(P<0.05),梓醇与AG490联合使用,即AG490+梓醇组,共定位位点数目和IOD值较AG490组明显增加(P<0.05),显示梓醇可以部分抵消AG490对脑缺血后脑微血管新生的抑制效应,提示梓醇可能增强STAT3的活化水平而发挥其促进脑缺血后血管新生效应。结论:1.梓醇具有减轻局灶永久性脑缺血大鼠脑血管内皮水肿、改善神经行为学评分的药效,6h和24h给药均有治疗作用,具有较长的治疗时间窗;1、5、10 mg?kg-1均有治疗作用,5mg?kg-1体重剂量疗效果最佳;2.梓醇的脑保护作用具有多途径、多靶点的特点。其作用机制与以下途径有关:(1)梓醇能够通过血脑屏障;(2)梓醇减轻脑微血管内皮水肿,增加神经元突触数目,梓醇可干预神经血管可塑性调节;(3)梓醇促进多效性神经保护因子EPO、VEGF蛋白和轴突生长蛋白GAP-43表达。3.梓醇通过STAT3信号通路促进脑缺血后血管新生(1)脑缺血后,STAT3信号通路与血管新生关系密切;(2)梓醇促进血管新生机制与促内皮细胞黏附、增殖和迁移有关,与促血管新生因子EPO和VEGF蛋白表达上调有关;(3)梓醇促血管新生作用至少部分通过STAT3信号通路实现。