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自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)在显花植物中普遍存在,是植物采取的一种促进异交、避免自交的策略,在植物进化过程中起着非常重要的作用。对显花植物自交不亲和性的研究不仅在植物生殖生物学上具有重要的研究意义,而且在杂交种生产等方面也有着重要的实际应用价值。ARC1(arm repeat containing 1,ARC1)是目前鉴定出来的芸苔属植物SI信号复合体下游传递因子,特异性地介导植物SI信号传递。为了进一步研究信号因子ARC1在芸苔属植物的表达情况,我们利用原核表达纯化技术得到了ARC1的羧基端蛋白ARC1-C并且制备了其单克隆抗体。通过本文的研究,为植物自交不亲和发生、发展机制的研究提供了基础,同时也为人们更好地利用自交不亲和提供理论依据。目前进行了以下几方面研究并得到如下结果:1、以PBS-BoARC1为模板并设计特异性引物,PCR扩增编码羽衣甘蓝ARC1的全长序列AARC1-F、编码氨基端UND结构域的序列ARC1-N和编码羧基端ARM结构域的序列ARC1-C。其中ARC1-F为1989 bp、ARC1-N为827 bp,ARC1-C为909 bp,这与琼脂糖电泳检测的结果一致。将这三种PCR产物分别插入到表达载体pET-14b中。构建了相应的表达载体,命名为14b-ARC1-F、14b-ARC1-N和14b-ARC1-C。将这三种载体转化到DH5a感受态中进行扩大。通过PCR的方法鉴定出阳性菌株后,提质粒,再对质粒进行双酶切鉴定。将阳性质粒转化到BL21中,最终获得相应的表达菌株,分别为ARC1-F-BL21、ARC1-F-BL21和ARC1-F-BL21。利用原核诱导表达纯化技术制备了ARC1的全长蛋白ARC1-F(1-663)、氨基端蛋白ARC1-N(1-279)和羧基端蛋白ARC1-C(361-663)。通过 SDS-PAGE 电泳检测,ARC1-F 的大小为 69 kD,ARC1-N 为32 kD,ARC1-C为38 kD,其中ARC1-C蛋白纯度最高。2、通过体外泛素化反应分析ARC1的E3酶活性,在同泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和细菌底物反应后,利用免疫印迹技术分析。结果显示,当泛素化反应的必要组分齐全时,ARC1能够介导细菌蛋白形成多泛素化;当单一地除去泛素化反应的必要组分后,ARC1则不能够介导细菌蛋白形成多泛素化。值得注意的是,当ARC1的U-box结构域反生改变后,即其保守的323位点Pro突变为Ala(BoARC1P323A),也没有检测到细菌蛋白形成多泛素化。从而可以推断ARC1具有E3泛素连接酶活性,而且其U-box结构域起到非常重要的作用。3、由于ARC1-C蛋白的纯度最高,因此用ARC1-C作为抗原免疫Balb/C小鼠。经过三次免疫和一次加免后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。经过高通量筛选后,分别筛选到2株阳性杂交瘤细胞。经过多次亚克隆后,最终得到2株分泌单克隆抗体的细胞株。经蛋白A亲和纯化获得相应单克隆抗体,命名为anti-ARC1-C mAb-8和anti-ARC1-C mAb-10。利用ELISA技术对这两株单克隆抗体进行效价检测,anti-ARC1-C mAb-8的效价达到10-8,anti-ARC1-C mAb-8的效价达到10-7。免疫印记技术结果显示,anti-ARC1-C mAb-8 和 anti-ARC1-C mAb-10 都可以与 ARC1-F 和 ARC1-C 很好的结合,且与ARC1-N没有交叉现象。4、为了分析ARC1在羽衣甘蓝不同花组织中的表达情况,分别提取羽衣甘蓝花瓣、花药、柱头、花柱、子房的总蛋白。利用免疫印迹技术和制备的单克隆抗体anti-ARC1-C mAb-8对ARC1进行检测,结果显示ARC1特异性地在柱头中表达,在其他花组织中不表达。为了进一步分析ARC1在柱头不同发育时期的表达水平,分别提取柱头长度为0-4 mm、4-6 mm、6-8 mm、8-10 mm、>10 mm的总蛋白。利用免疫印迹技术检测,结果显示随着柱头的发育和伸长,ARC1表达量也逐渐增多。