背景慢性应激可以导致两种不同的表型:面对相同程度的应激,可以维持其正常的心理、生理功能为应激耐受型(stress resilience,SR);反之,不能维持其正常心身功能,并容易引发抑郁症、创伤后应激障碍等严重精神障碍为应激易感型(stress susceptible,SS)。目前研究提示,慢性社交应激模型能较好的模拟人类的应激;在这类SR表型中可能发生了不同于SS表型的多水平主动适应性神经生物和心理行为的改变。因此,从影像、蛋白质组学、行为学水平对SS和SR表型进行研究,有助于从另一个角度揭示其易感机制、辅助筛选特异性的生物标志物,亦有助于对应激相关精神障碍提供新的防治思路。海马是与应激关联最密切的脑区之一,不仅可以调控机体的应激反应,同时也受应激影响而在其结构及功能上发生改变,已有研究发现海马的体积、组织微结构与应激相关精神障碍的发生发展密切相关。但由于海马的双重角色作用,基于横断面的研究很难判断其与应激相关精神障碍之间的发生机制。而目前应激小鼠模型的建立、影像学技术的发展,都为开展纵向研究、探寻发生机制提供了更多的可能。另一方面,海马在其左、右及背(dorsal hippocampus,dHi)、腹侧(ventral hippocampus,vHi)的结构和功能上均存在不对称性,因此将海马作为一个研究整体,很可能会遮蔽其单侧、亚区的细微改变,从而导致目前研究结果的异质性,所以需要对其单侧亚区分别进行讨论。蛋白质组学可以反映基因和环境之间相互的综合作用,更贴近应激相关精神障碍“素质-应激模型”理论提出的病生机制。同位素相对标记与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术具有高通量、高灵敏度与高定量精度的特点,可以鉴定不同应激行为表型的全部蛋白质表达和功能模式,同时定量分析差异,为筛选应激相关精神障碍蛋白生物标志物提供了坚实的技术基础。基于海马组织的蛋白筛选,具有更高的组织特异性,而血液样本的易获取性,在纵向研究和临床转化应用上更具优势,因此两者的有机结合可以更完整的反映应激相关精神障碍蛋白层面的生理机制。因此,本研究建立慢性社交挫败应激(chronic social defeat stress,CSDS)模型,分得SS和SR两种行为表型小鼠;应用影像学核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)结合弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)的方法,对SS及SR小鼠的单侧海马背、腹侧分别进行体积和微结构改变上的纵向研究;再应用iTRAQ技术,分别对左、右侧海马以及应激前、后血清蛋白质组学的差异表达进行高通量定量分析。旨在从形态结构及蛋白层面揭示海马与应激易感和应激耐受的关系及其神经生物机制,单侧海马背、腹侧在应激下的偏侧性影响,并初步筛选SS及SR表型相关的蛋白生物标志物。方法1.CSDS小鼠模型的建立。连续10天同一时间,分别将C57BL/6J(C57)雄性小鼠放入改造过的大鼠笼(用带孔隔板将其一分为二)左侧,进入CD-1小鼠的领地,并让其接受CD-1小鼠攻击10分钟,一天内剩余时间则让其居于该鼠笼右侧,继续感受攻击鼠的存在,但不再发生身体接触。每天让应激组C57小鼠(n=17)接触新的CD-1小鼠并重复以上过程。对照组小鼠(n=7)居于相同的特制鼠笼,并与另一只C57小鼠分居两侧,不能有肢体接触,亦每日轮转到新的鼠笼。10天后,根据社交接触时间比(social interaction ratio,SIR)这一指标界定SS及SR表型小鼠,并通过行为学的社交实验、旷场实验、糖水偏好实验和强迫游泳实验观察两者不同的行为改变。2.CSDS易感与耐受小鼠双侧背/腹侧海马形态结构的纵向定量研究。应用高场强7.0T小动物MRI分别在应激前、后对实验小鼠部分大脑进行T2结构相、DTI序列扫描,根据图谱分别勾勒出小鼠左、右海马背、腹侧,再基于感兴趣区(region of interest,ROI)的方法对各脑区进行体积和微结构参数的定量分析。3.基于iTRAQ的海马差异蛋白定量研究。应用iTRAQ的方法,对SS、SR表型小鼠的左、右海马分别进行蛋白定量,筛选单侧海马的组间差异表达蛋白以及各组双侧海马之间的差异蛋白,对其进行包括在细胞组分、分子功能、生物过程的基因本体论(gene ontology,GO)富集分析和蛋白通路富集分析,并初步筛选有潜力的海马蛋白生物标志物。4.基于iTRAQ的血清差异蛋白的纵向定量研究。应用iTRAQ的方法,分别对SS、SR表型小鼠应激前、后的血清样本进行蛋白定量,筛选单个时间点的组间差异蛋白以及各组应激前后表达有显著改变的蛋白,同样进行GO和蛋白通路富集分析,并初步筛选有潜力的血清生物标志物。结果1.建立CSDS模型,并根据是否出现社交回避这一核心行为指标,成功得到了SS(n=10)及SR(n=7)两种行为表型的小鼠。行为学结果显示,两个应激组小鼠在强迫游泳的不动时间显著增加,但在焦虑样行为、活动力、体重、糖水偏好等方面没有统计学差异。2.海马体积纵向研究发现,应激前,三组小鼠海马各ROI标准化体积并没有统计学差异;应激后,SR组小鼠右海马体积显著大于其他两组,且具体体现在右vHi体积的显著增加;应激后小鼠的右海马总体积、右vHi体积均与其SIR呈显著正相关。3.海马组织微结构的纵向研究结果显示,应激前,SS组小鼠右vHi的各向异性分数(fractional anisotropy,FA)显著低于SR组,提示应激前组织微结构的异常可能是导致应激易感表型出现的原因。应激后,SR组小鼠的平均扩散系数(mean diffusivity,MD)、垂直扩散系数(radial diffusivity,RD)均显著大于SS组,轴向扩散系数(axial diffusivity,AD)在各组小鼠应激前、后海马各ROI均无统计学差异。纵向改变上,只有SR组右dHi的RD有显著增加;SIR与应激后左海马MD、右dHi的MD、RD以及应激前后右dHi的MD纵向改变量均有显著的正相关。偏侧性参数相关结果提示应激对右vHi的组织完整性上产生了偏侧性影响。4.海马蛋白质组学方面,左海马SR组差异表达蛋白的数量多于SS组,在右海马则正相反。左海马各组差异蛋白的富集条目则基本一致,右海马两组的差异蛋白在细胞组成、分子功能、生物过程均有不同的富集特征,并富集于突触囊泡循环通路、MAPK信号通路、胰岛素分泌通路、海马信号通路、SNARE在突触囊泡转运中的相互作用、辅助性T细胞的分化等蛋白通路,提示右海马可能在应激行为表型的形成上具有更重要的调控功能。两个应激组之间特异表达的差异蛋白有潜力成为海马蛋白生物标志物,包括左海马的MBP、NLRP-1、GTPase HRas、朊蛋白、膜联蛋白A7,右海马的PPP3CB、14-3-3β、14-3-3ζ/δ、CLIC6、触珠蛋白、TTR等,并提示应激行为表型与髓鞘形成、神经细胞凋亡、能量代谢、轴突及突触可塑性、激素等机制有关。最后,对各组小鼠双侧海马之间的偏侧性研究发现,SS小鼠在左右海马之间的蛋白表达差异性更大,提示易感表型可能跟其右海马下调的差异蛋白在轴突导向、海马信号通路富集有关。5.血清蛋白质组学纵向研究发现,应激前、后,各组的差异表达蛋白在细胞组成、分子功能、生物过程中均有不同的富集特征。两个应激组共有的、但不同步调控的差异蛋白即可能是有效的生物标志物,包括14-3-3ζ/δ、ApoB-100、LBP、IGKC等,并与代谢、免疫等机制密切相关。纵观应激前后,在差异表达蛋白的数量上是SR组最多,但聚类分析结果却显示易感组的改变模式要远于其他两组。结论1.右海马(尤其是右vHi)与SR表型密切相关,有潜力作为应激相关精神障碍治疗及应激耐受训练的有效靶点。2.SS和SR表型小鼠在右海马差异蛋白的不同富集特征,说明相较于左海马,右海马在应激行为表型的形成上可能具有更重要的调控功能,并主要体现在突触囊泡循环及转运通路、海马信号通路等蛋白通路。3.基于双侧海马及纵向血清的蛋白质组学分析,初步筛选了两个组织在应激耐受性方面的蛋白生物标志物,MBP、膜联蛋白A7、PPP3CB、14-3-3β、14-3-3ζ/δ、ApoB-100、LBP、IGKC等,并聚焦于髓鞘形成、神经细胞凋亡、轴突及突触可塑性、能量代谢、激素、免疫等机制,为应激相关精神障碍的发病机制提供新的研究重点。