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[目 的]本研究拟从免疫炎症反应的角度阐明TLR4细胞膜受体在肺纤维化发生发展中的作用,从而全面研究TLR4在肺纤维化中的作用机制,旨在观察TLR4是否通过NF-κB信号通路进而引起IL-1 β水平的变化,最终影响肺纤维化的形成。[方 法]1.MRC-5细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中,37℃,5%CO2下培养,取对数生长期的细胞,使用0.25%胰酶消化法1:2进行传代。采用TGF-β1(80ng/ml)干预人肺成纤维细胞MRC-5细胞构建体外肺纤维化模型,通过Western blot、细胞免疫荧光、Q-PCR分析MRC-5细胞中Ⅰ型胶原蛋白(Collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ),Ⅲ 型胶原蛋白(Collagen-Ⅲ,COL-Ⅲ),α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscel actin,α-SMA)蛋白及其mRNA的表达情况来鉴定模型。设置NC组(正常组)、TGF-β 1组(模型对照组)、TAK-242+TGF-β1组(TLR4抑制剂干预组)、LPS+TGF-β 1组(TLR4诱导剂干预组)、PDTC+TGF-β 1组(NF-κ B抑制剂干预组)。1.1 NC组、TGF-β1组,采用Western blot、细胞免疫荧光、Q-PCR分析各组MRC-5细胞中TLR4蛋白及其mRNA的表达情况,研究TGF-β 1诱导的MRC-5细胞纤维化过程中TLR4的表达。1.2 NC 组、TGF-β 1 组、TAK-242+TGF-β 1 组、LPS+TGF-β 1 组。采用 Western blot、细胞免疫荧光、Q-PCR分析各组MRC-5细胞中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA,研究TGF-β 1诱导的MRC-5细胞纤维化过程中TLR4的高表达是否与肺纤维化有关,及其起到何种作用。1.3 NC 组、TGF-β 1 组、TAK-242+TGF-β 1 组、LPS+TGF-β 1 组、PDTC+TGF-β 1组。采用Western blot、细胞免疫荧光、Q-PCR分析各组MRC-5细胞中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA、TLR4、P65蛋白及其mRNA的表达情况,研究TGF-β1诱导的MRC-5细胞纤维化过程中TLR4的促肺纤维化作用,是否通过调控NF-κ B发挥作用。1.4 NC 组、TGF-β 1 组、TAK-242+TGF-β 1 组、LPS+TGF-β 1 组、PDTC+TGF-β 1组。采用Q-PCR分析各组MRC-5细胞中IL-1 β mRNA的表达情况,研究TGF-β 1诱导的MRC-5细胞纤维化过程中TLR4/NF-κ B的促肺纤维化作用,是否通过调控IL-1 β发挥作用。1.5 NC 组、TGF-β 1 组、TAK-242+TGF-β 1 组、LPS+TGF-β 1 组、PDTC+TGF-β 1组。采用EDU染色法分析各组MRC-5细胞的增殖情况,研究干预TLR4、NF-κ B表达,对TGF-β 1诱导的MRC-5细胞纤维化过程中细胞增殖的影响。[结 果]1.TLR4在TGF-β 1诱导的MRC-5细胞中的表达及作用:Western blot检测TGF-β 1诱导的MRC-5细胞中TLR4蛋白的表达,结果显示TLR4表达升高,细胞免疫荧光、Q-PCR与Western blot结果一致。Western blot检测TLR4诱导剂和抑制剂分别干预的TGF-β 1诱导的MRC-5细胞中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA蛋白的表达,结果显示抑制TLR4表达时,可抑制TGF-β 1诱导的MRC-5细胞胶原的分泌及转化,诱导TLR4表达时,可促进TGF-β 1诱导的MRC-5细胞胶原的分泌及转化,细胞免疫荧光、Q-PCR与Western blot结果一致。结果表明TLR4在肺成纤维细胞纤维化过程表达升高,促进细胞纤维化过程中胶原的分泌及转化。2.TLR4调控TGF-β 1诱导的MRC-5细胞纤维化的具体机制:Western blotting检测TLR4诱导剂、TLR4抑制剂、NF-κ B抑制剂分别干预的TGF-β 1诱导的MRC-5细胞中TLR4、NF-κ B蛋白的表达,结果显示在TGF-β 1诱导的MRC-5细胞中抑制和诱导TLIR4蛋白表达时,NF-κ B蛋白被同步抑制和诱导表达,而当抑制NF-κ B蛋白表达时,NF-κ B蛋白表达被抑制,但TLR4蛋白表达无明显变化,细胞免疫荧光、Q-PCR与Western blot结果一致。结果表明TLR4可能通过调控其下游的NF-κ B信号分子,发挥促进TGF-β 1诱导的MRC-5细胞胶原分泌及转化的作用。进一步抑制NF-κ B蛋白的表达,Western blot检测NF-κ B抑制剂干预的TGF-β 1诱导的MRC-5细胞中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA蛋白的表达,结果显示抑制NF-κ B表达时,可抑制TGF-β 1诱导的MRC-5细胞胶原的分泌及转化,细胞免疫荧光、Q-PCR与Western blot结果一致。结果表明TLR4可通过炎症通路关键信号分子NF-κ B促进TGF-β1诱导的MRC-5细胞纤维化过程中胶原的分泌及转化。3.TLR4-NF-κ B信号通路调控MRC-5细胞纤维化的作用分子:Q-PCR检测TLR4诱导剂、TLR4抑制剂、NF-κ B抑制剂分别干预的TGF-β 1诱导的MRC-5细胞中IL-1 β mRNA的水平,结果显示TLR4、NF-κ B表达被诱导时,IL-1 β mRNA的水平增强,TLR4、NF-κ B表达被抑制时,IL-1β mRNA的水平降低。结果说明TLR4/NF-κ B可能通过调控IL-1 β发挥促TGF-β 1诱导的MRC-5细胞肺纤维化过程中转化、增殖及胶原的分泌的作用。4.干预TLR4-NF-κ B信号通路表达对TGF-β 1诱导的MRC-5细胞增殖的影响:EDU染色法检测TLR4诱导剂、TLR4抑制剂、NF-κ B抑制剂分别干预的TGF-β 1诱导的MRC-5细胞中处于增殖状态的细胞数量,结果显示TLR4、NF-κ B表达被诱导时细胞增殖趋势上升,TLR4、NF-κ B表达被抑制时细胞增殖趋势明显下降。结果说明TLR4-NF-κB信号通路激活时,可以促进MRC-5细胞的增殖,抑制TLR4-NF-κ B信号通路后,细胞增殖明显受限。[结论]1、TLR4在TGF-β 1诱导的MRC-5细胞纤维化过程中高表达,且促进TGF-β 1诱导的肺纤维化过程中转化、增殖及胶原的分泌。2、TLR4可通过调节炎症通路关键信号分子NF-κ B促进TGF-β 1诱导的MRC-5细胞纤维化过程中转化、增殖及胶原的分泌。3、TLR4/NF-κ B通过调控IL-1 β发挥促TGF-β 1诱导的MRC-5细胞肺纤维化过程中转化、增殖及胶原的分泌的作用。