论文部分内容阅读
鸡的卵泡发育是一个非常复杂、高度协调的生理过程,而在卵泡的整个生长发育过程当中伴随着血管系统的增殖和衰退。作为卵巢组织中含量最丰富,功能最强大的促血管生成因子,血管内皮生长因子(VEGF)能够促进血管新生和提高血管的通透性,对维持卵巢功能及卵泡发育起重要的作用。本实验室前期通过高通量测序,发现miR-26a-5p在鸡性成熟前后的卵巢组织中差异表达,且在鸡等级卵泡膜细胞中过表达miR-26a-5p筛选出许多与血管发育相关的差异基因,推测miR-26a-5p可能参与鸡卵泡血管的发育调控。本研究对鸡等级卵泡颗粒细胞中miR-26a-5p调控VEGFA表达的分子机制进行了分析,结果如下:1.转录组测序方法揭示鸡卵泡颗粒细胞中受miR-26a-5p调控的基因。在鸡等级卵泡的颗粒细胞中过表达miR-26a-5p并进行转录组测序,以未过表达miR-26a-5p的颗粒细胞为对照,在过表达miR-26a-5p的等级卵泡颗粒细胞中共筛选出了686个差异表达基因,其中326个显著上调,360个显著下调。生物信息学分析发现差异表达基因多富集在apelin signaling pathway、TGF-βsignaling pathway、血管平滑肌收缩等与卵泡发育、血管发育相关的信号通路。SEMA3A、TLR-2、VEGFA、GSK-3β、FZD1、Wnt4、Wnt5a、CTNNB1等14个DEGs的表达变化通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)进行了验证。VEGFA是参与血管发育的重要因子,在卵泡血管发育与选择过程中起着重要的调控作用,故将VEGFA作为研究血管发育的候选基因进行了表达调控的深入研究。2.miR-26a-5p靶向NLK下调VEGFA的表达。本课题组前期证明了miR-26a-5p能靶向结合NLK基因的3’UTR,本研究在GCs中过表达miR-26a-5p后qRT-PCR和Western Blot检测发现NLK在mRNA和蛋白水平均显著下调,进一步验证了两者的靶向调控关系。分别将miR-26a-5p mimic、inhibitor和NLK siRNA转染至GCs后,结果显示miR-26a-5p的高表达能显著抑制VEGFA在mRNA水平和蛋白水平的表达,而miR-26a-5p的低表达能使VEGFA在mRNA水平和蛋白水平的表达量显著升高。干扰其靶基因NLK表达后,VEGFA在mRNA水平和蛋白水平均显著下调,与过表达miR-26a-5p结果一致。这表明miR-26a-5p能通过靶向NLK下调VEGFA的表达。3.miR-26a-5p靶向NLK通过下调β-catenin的表达对VEGFA的调控。β-catenin是Wnt/β-catenin经典信号通路的核心成员,将miR-26a-5p mimic、inhibitor和NLK siRNA转染至GCs检测β-catenin的mRNA和蛋白表达水平后发现,miR-26a-5p的高表达上调β-catenin的表达量,抑制miR-26a-5p后β-catenin显著下调,而当干扰NLK后β-catenin显著上调,与过表达miR-26a-5p的结果一致,同时伴随着VEGFA表达下调。构建β-catenin的过表达载体转染至GCs验证VEGFA在mRNA、蛋白水平的表达量,结果显示随着β-catenin表达量的升高,VEGFA的表达量显著下调。4.miR-26a-5p、Wnt蛋白对VEGFA的调控。转录组结果也筛选出与Wnt相关的差异表达基因,故分析了miR-26a-5p对Wnt相关基因的影响。在GCs中过表达miR-26a-5p能显著上调Wnt5a的表达,但抑制miR-26a-5p后却基本不受其影响。miR-26a-5p能显著上调Wnt4,当miR-26a-5p的表达被抑制后,Wnt4也随之显著下调,而沉默NLK后,Wnt4呈上调趋势(P>0.05)。说明miR-26a-5p能激活Wnt4,但并不是通过NLK的调控。过表达Wnt4后VEGFA显著上调而干扰Wnt4会下调VEGFA的表达(P>0.05)。以上结果说明Wnt4的表达变化会影响VEGFA的表达,即VEGFA可能受Wnt经典通路的影响。为了进一步验证Wnt通路对VEGFA的影响,在GCs经IWR-1(Wnt通路抑制剂)处理后发现β-catenin、NLK、VEGFA均显著下调,结果说明VEGFA的表达受Wnt通路调控。5.miR-26a-5p对鸡等级卵泡颗粒细胞增殖凋亡的影响。在鸡GCs中分别过表达miR-26a-5p、干扰NLK检测细胞的凋亡情况,结果显示在GCs中细胞凋亡数目呈下降趋势。过表达miR-26a-5p后抑凋亡基因BCL-2的表达显著上调,促凋亡基因Caspase-3的表达显著下调,结合实验室前期的增殖结果,miR-26a-5p能促进GCs的增殖。