小鼠胚胎干细胞是由囊胚内细胞团细胞经体外培养分离而来,其基因表达谱与内细胞团细胞类似,同时也具有无限的自我更新能力及发育上的多能性。小鼠胚胎干细胞自我更新能力及多能性的维持受到体内体外多重因素的复杂调控。小鼠胚胎干细胞中多能性基因并不是均质性表达的,部分基因的表达模式是异质性的,在这些异质性表达的基因中Zscan4是一个表达模式非常特异的基因。Zscan4只在小鼠ES细胞及2细胞胚胎中表达,并且只在3-5%的小鼠ES细胞中表达,表达是时刻发生变化的,Zscan4+及Zscan4细胞之间可以相互转换。Zscan4在小鼠ES细胞及早期胚胎正常发育中行使着重要的功能,在小鼠ES细胞中Zscan4通过激活端粒末端重组的方式延长端粒并且能够维持小鼠ES细胞基因组的稳定性。在小鼠ES细胞中Zscan4缺失后将导致染色体核型的缺陷,端粒缩短最后细胞不能继续增殖。在早期胚胎发育中缺失Zscan4将导致胚胎发育延迟,囊胚不能有效着床而死亡。Zscan4的独特表达模式表明Zscan4必定受到严格的基因表达调控,但是Zscan4受到怎样的调控目前并不清楚。本论文将探讨Zscan4是如何被控制在3-5%的细胞中表达的,具体的调控机制是如何的,这部分细胞又有着怎样的生物学意义。实验结果表明Zscan4受到Rifl的负调控。Rifl在小鼠ES细胞及睾丸中高表达,在小鼠ES细胞中起着调节ES细胞异质性、维持端粒长度恒定及基因组稳定性的作用。Rifl缺失后通过激活Zscan4的表达从而激活端粒处的染色体重组(T-SCE)以端粒延长替代机制(ALT)来延长端粒,并且端粒融合和丢失加剧。而在Rifl KD细胞中干扰Zscan4恢复Zscan4的表达后,T-SCE也得到恢复并且异常延长的端粒也得到恢复。高频率的端粒重组将导致端粒缺陷及基因组的不稳定。Rifl缺失导致小鼠ES细胞自我更新能力及多能性显著下降,并且胚胎发育能力也是显著下降的。Rifl缺失引起的缺陷主要由Zscan4高表达介导的异常高的端粒重组引起的,恢复Zscan4的表达后细胞的增殖能力及胚胎发育能力都得到有效恢复。表明Zscan4在小鼠ES细胞中必须维持在恒定的表达水平,表达升高及下降对小鼠ES细胞的自我更新和多能性以及早期胚胎发育都是不利的。有趣的是Zscan4通过自身SCAN结构域激活自身的表达,形成一个正向的回路调控自身的表达。没有Rifl的抑制作用,小鼠ES细胞中将有更多的细胞是Zscan4+阳性的(Rift缺失后上升到11%左右),从而激活异常高的T-SCE,对小鼠ES细胞是不利的,Rif1在小鼠ES细胞中高表达抑制了这种可能,使Zscan4+维持在3-5%的低水平,维持小鼠ES细胞的正常生物学功能。另外,Rif1是一个转录抑制因子,基因表达谱分析表明Rif1缺失后表达上升的基因数目明显多余下降的基因数目。并且对基因表达谱的详细分析表明部分上升的基因(占上升基因数量的13%)位于亚端粒区域,包括Zscan4、Tcstvl/3等。端粒及亚端粒区域结合着大量的抑制性的表观遗传调控因子,如DNA甲基化修饰、组蛋白甲基化修饰(如H3K9me3及H4K20me3),这些抑制性的表观遗传修饰都是端粒长度的负调节因子。抑制性的表观遗传修饰会有助于形成高度浓缩的异染色质结构,通过端粒位置效应(TPE)抑制临近基因的表达。分子机制上的研究近一步发现Rif1是H3K9甲基化超级复合体中的新成员,特异的与H3K9me3及H3K9me3甲基化超级复合体各成员相互作用,起到稳定H3K9甲基化超级复合体的作用。Rifl的缺失导致介导H3K9甲基化复合体各成分之间相互作用的桥梁不存在了,破坏了H3K9甲基化超级复合体成员之间的相互联系,另外各成员之间的相互作用也减弱了,从而导致不能形成紧密的复合体了。游离的H3K9甲基化超级复合体成员会加速降解,G9a、Setdb1、Kap1、HP1α及Glp蛋白水平都是下降的。H3K9me3甲基转移酶的降解导致H3K9me3甲基化水平的下降以及在Rif1抑制基因启动子处的结合也大为下降,最终解除了Rif1对近着丝粒、端粒及亚端粒区域基因表达的抑制。Zscan4除了受到Rif1的表观遗传调节,我们的结果发现Zscan4也受到Tbx3的表观遗传调节。我们发现Ybx3是一个新的Zscan4+/2C state及端粒长度的调节因子,Tbx3OE降低Dnmt3b的表达及升高Tet2的表达,从而协同地降低小鼠ES细胞中DNA甲基化水平来调节Zscan4的表达及端粒的延长。另外除了受端粒亚端粒处高富集的抑制性的DNA甲基化及组蛋白甲基化表观遗传负调控,Zscan4也受到端粒及亚端粒处少量结合的组蛋白乙酰化的正向调控。我们首次证明组蛋白的乙酰化也同样参与了小鼠ES细胞中端粒长度的调控,并且是通过调节Zscan4等2细胞基因来实现的。端粒酶缺失的晚代小鼠G4ES细胞虽然增殖能力及多能性较正常的小鼠ES细胞都有所下降,但是仍然能分裂450次之多。维持正常的端粒长度对细胞中正常的生命活动维持有着重要的作用,端粒长度缩短到一定的阈值后将引发细胞的增殖衰老,细胞最终走向死亡。那么在端粒酶缺失的晚代小鼠G4ES细胞中端粒长度又是怎样变化的呢,通过什么途径来解决端粒末端序列丢失的问题呢?我们结果表明G4Terc-/-ESC在培养过程中端粒维持在恒定的长度,G4Terc-/-ESC中抑制性的表观遗传修饰DNA甲基化及H3K9me3都是下降的而激活性的AcH3是上升的,从而导致端粒位置效应下降、Zscan4表达上升,补偿因端粒酶缺失而引起的端粒重复序列丢失,进化上完美解决了端粒丢失的问题。另外占人肿瘤10-15%的端粒酶缺失的ALT细胞以ALT机制延长端粒,包括U2OS细胞。在U2OS细胞中H3K9me3是下降的而AcH3是上升的,导致ZSCAN4表达也是显著升高的,同样受到表观遗传的调控。ZSCAN4可能是ALT产生的原因,ZSCAN4的缺失也导致端粒缩短及增殖能力的部分下降,也补偿着ALT细胞端粒长度的丢失,成为肿瘤治疗的有效靶点。端粒酶抑制剂抑制端粒酶阳性肿瘤会使一部分细胞利用ALT机制逃离抑制,限制了其临床应用前景。因此,联合端粒酶抑制剂及ALT抑制剂将可能最终实现治愈肿瘤的目的。