研究目的乳腺癌是中国女性发病率最高的癌症,其死亡率高居第六位,而且其发病率和死亡率还在逐年攀升。乳腺癌细胞通过血液和淋巴管等从原发部位转移到肝脏、肺等新的器官,乳腺癌的浸润、转移是乳腺癌患者死亡的主要原因之一。而且在临床上,随着各种化学药物对乳腺癌患者的持续使用,乳腺癌细胞逐渐对化疗药物产生耐药性。因此,化疗耐药(Chemotherapy resistance)是导致化疗失败的主要原因。过度表达的多药耐药基因1(multi drug resistance 1,MDR1)及多药耐药蛋白P-糖蛋白(P-gp)将进入癌细胞内的阿霉素、紫杉醇等化疗药物泵出细胞外是肿瘤细胞产生化疗耐药的重要机制。抑制乳腺癌的浸润转移和化疗耐药是乳腺癌治疗的关键环节。因此,寻找新的抑制乳腺癌浸润转移和化疗敏感性的分子对乳腺癌的临床诊断和治疗具有极其重要的意义。TIPE3,即 TNFAIP8L3(tumor necrosis factor α-induced protein 8 like 3),是新近研究发现的促肿瘤分子,在宫颈癌、结肠癌和肺癌等多种人类肿瘤细胞系及具有分泌功能的组织细胞中高表达。TIPE3将运磷酸肌醇二磷酸(PtdIns(4,5)P2)或磷酸肌醇三磷酸(PtdIns(3,4,5)P3)转运给磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和磷脂酶C(PLC),进而激活下游PI3K-AKT和ERK信号通路,促进肿瘤的发生和发展。然而,TIPE3在乳腺癌生长、浸润转移和化疗敏感性中的作用未见报道。因此,我们以临床病例、细胞模型、动物实验系统的研究了 TIPE3在乳腺癌发生、浸润转移及化疗敏感性中的作用,并对其机制进行了探讨。研究方法1.临床标本检测TIPE3蛋白在人类乳腺癌组织中的表达并分析与病理特征的相关性1.1免疫组化检测TIPE3在乳腺癌病理标本中的表达收集乳腺癌患者临床样本和组织样本微芯片,采用免疫组化方法检测TIPE3蛋白在乳腺癌旁组织、原位癌、浸润癌及淋巴结转移处乳腺癌中的表达。1.2分析TIPE3的表达水平与临床样本病理特征的相关性分析比较TIPE3蛋白分别在乳腺癌和癌旁组织、原位癌和浸润癌、浸润癌和淋巴结转移癌中的表达水平差异,分析TIPE3蛋白表达水平与肿瘤大小、患者发病年龄以及ER、PR、Her2表达水平等临床病理特征之间的相关性。2.细胞实验研究TIPE3蛋白调控乳腺癌恶性行为及其机制2.1检测TIPE3蛋白在Her2表达水平不同的乳腺癌细胞系中的表达通过Western blot的方法检测TIPE3在Her2表达阳性的SKBR3细胞和Her2表达阴性的MCF-7和MDA-MB-231细胞中的表达情况,分析比较TIPE3表达和Her2表达的相关性。2.2检测TIPE3蛋白在不同侵袭能力乳腺癌细胞系中的表达通过Western blot和qRT-PCR的方法检测TIPE3高侵袭能力的MDA-MB-231和BT549细胞和低侵袭能力的MCF-7和MDA-MB-468细胞中的表达情况,分析比较TIPE3表达和乳腺癌细胞侵袭能力的相关性。2.3 TIPE3调控乳腺癌细胞增殖的研究对低表达TIPE3的MCF-7细胞和高表达TIPE3的MDA-MB-231细胞转染TIPE3表达质粒使TIPE3高表达,同时对高表达TIPE3的MDA-MB-231感染siRNA-TIPE3慢病毒干扰TIPE3的表达,采用CCK-8、软琼脂集落形成实验和流式细胞周期检测TIPE3过表达和干扰前后乳腺癌细胞生存能力的变化。2.4 TIPE3调控乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力研究以细胞划痕、Transwell迁移实验检测过表达或干扰TIPE3前后MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移能力的变化,Transwel侵袭实验检测过表达或干扰TIPE3前后MCF-7和MDA-MB-231细胞侵袭能力的变化。2.5 TIPE3影响MCF-7细胞对阿霉素敏感性的研究2.5.1使用CCK-8方法检测TIPE3对阿霉素处理MCF-7细胞相对活性的影响以0、0.5、1.0、1.5 μg/mL浓度的阿霉素作用于过表达TIPE3前后的MCF-7细胞,采用细胞活性检测试剂盒(CCK-8)分析TIPE3对阿霉素作用的MCF-7细胞相对活性的影响。2.5.2采用流式细胞术检测TIPE3对阿霉素处理MCF-7细胞周期分布的影响以0.5 μg/mL浓度的阿霉素作用于过表达TIPE3前后的MCF-7细胞,流式细胞术分析TIPE3对阿霉素作用的MCF-7细胞周期分布的影响。2.5.3采用流式细胞术检测TIPE3对阿霉素处理MCF-7细胞凋亡的影响以0.5μg/mL浓度的阿霉素作用于过表达TIPE3前后的MCF-7细胞,采用Annexin V/PI染色流式细胞术检测TIPE3对阿霉素作用的MCF-7细胞凋亡的影响。2.6 TIPE3调控乳腺癌细胞恶性行为和阿霉素敏感性的机制研究2.6.1 TIPE3调控乳腺癌细胞恶性行为的机制研究MCF-7和MDA-MB-231细胞过表达或干扰TIPE3表达后,采用Western blot检测TIPE3对乳腺癌细胞AKT、NF-κB信号相关分子p-AKT、p-lKBα和p-P65活化的影响,并检测入核信号分子P-P65在胞核和胞质中表达的变化。以qRT-PCR从RNA水平检测侵袭相关分子MMP2和uPA mRNA的表达。最后使用PI3K-AKT和NF-κB信号通路抑制剂LY294002和CAPE抑制信号通路,检测TIPE3对信号通路的活化及促进乳腺癌增值迁移的效应是否被抑制,进一步证明TIPE3的作用机制。2.6.2 TIPE3调控MCF-7细胞阿霉素敏感性的机制研究MCF-7细胞首先用阿霉素处理,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印记(Western blot)方法检测核因子-kappaB(NF-κB)信号通路活化情况和多药耐药基因l(MDR1)及多药耐药蛋白P-糖蛋白(P-gp)表达。最后使用NF-κB信号通路抑制剂CAPE进一步验证TIPE3的作用机制。3.动物实验证TIPE3对乳腺肿瘤生长和转移的影响以乳腺癌细胞MDA-MB-231皮下接种裸鼠制备成瘤模型,或尾静脉注射制备转移瘤模型,动物实验验证TIPE3对乳腺肿瘤生长和转移的影响。3.1裸鼠皮下成瘤模型观察TIPE3促胂瘤生长作用裸鼠皮下注射MDA-MB-231细胞,分别给予对照质粒和TIPE3表达质粒,每隔一天测量肿瘤大小,并计算瘤体体积,21天后取出瘤体,称重并测量瘤体大小,并拍照记录,绘制肿瘤生长曲线。Western blot和免疫组化检测瘤体中TIPE3表达情况。3.2裸鼠尾静脉注射肺转移模型观察TIPE3促肿瘤转移作用裸鼠尾静脉注射慢病毒干扰TIPE3表达的MDA-MB-231细胞和对照细胞,50天左右处死老鼠,取肺观察转移灶形成大小和数量,包埋肺组织做石蜡切片,HE染色观察转移灶大小和数量。研究结果1.TIPE3蛋白的表达水平与乳腺癌恶性程度呈正相关结果发现TIPE3在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且在浸润癌中的表达明显高于原位癌,在转移到淋巴结的乳腺癌组织中的表达明显高于同—病人未转移的浸润癌。并且TIPE3的表达与乳腺癌恶性程度指标Her2的表达成正相关,而与肿瘤大小、患者年龄、ER、PR的表达水平没有明显相关性。2.TIPE3蛋白通过AKT/NF-κB信号通路调控乳腺癌细胞的恶性行为2.1 TIPE3在Her2表达阳性乳腺癌细胞内的表达高于Her2表达阴性乳腺癌细胞结果发现TIPE3在Her2表达阳性的SKBR3细胞中高表达,在Her2表达阴性的MCF-7和MDA-MB-231细胞中低表达,说明TIPE3的表达与乳腺癌细胞Her2表达水平呈正相关。2.2 TIPE3在高侵袭性乳腺癌细胞内的表达高于低侵袭能力乳腺癌细胞结果发现TIPE3在高侵袭能力的MDA-MB-231和BT549细胞高表达,在低侵袭能力的MCF-7和MDA-MB-468细胞低表达,说明TIPE3的表达可能与乳腺癌细胞的侵袭有关。2.3 TIPE3促进乳腺癌细胞的增殖过表达TIPE3促进MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖与克隆形成,而干扰TIPE3则抑制MDA-MB-231细胞的增殖与克隆形成。过表达TIPE3减少处于G0/G1期MCF-7细胞比例,增加S和G2M期细胞比例,而干扰TTPE3增加处于G0/G1期MDA-MB-231细胞比例,减少S和G2/M期细胞比例,表明TIPE3促进细胞周期进程。2.4 TIPE3促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭过表达ITPE3促进MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭,干扰TIPE3则抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭,表明TIPE3能够促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。2.5 TIPE3降低MCF-7细胞对阿霉素的敏感性2.5.1 TIPE3对阿霉素处理MCF-7细胞相对活性的影响检测发现过表达TIPE3的MCF-7细胞活性明显强于对照组,且呈现出剂量依赖性。2.5.2 TIPE3对阿霉素处理MCF-7细胞周期分布的影响阿霉素处理过表达TIPE3的MCF-7细胞,G0/G1期细胞数与未转染TIPE3的细胞相比较无显著性差异,但是S期细胞数显著减少,G2/M期细胞数增加,说明TIPE3促进阿霉素诱导的细胞由S期向G2/M期转化。2.5.3 TIPE3对阿霉素处理MCF-7细胞凋亡率的影响过表达TIPE3可减少MCF-7细胞的凋亡率,阿霉素处理可以增加MCF-7细胞凋亡率,过表达TIPE3抑制阿霉素处理MCF-7细胞凋亡率。2.6 TIPE3活化AKT/NF-κB信号通路调控乳腺癌浸润转移与阿霉素敏感性2.6.1 TIPE3活化PI3K-AKT/NF-κB信号通路上调MMP2和uPA表达过表达 TIPE3 增加 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞 p-AKT、p-IκBα 和 p-P65的活化水平,促进p-P65的入核,促进细胞侵袭相关分子MMP2和uPA的表达上调,而干扰IIPE3表达的MDA-MB-231细胞有相反的作用。在LY294002和CAPE作用下，TIPE3对PI3K-AKT和NF-κB信号通路的活化及促进乳腺癌细胞增值和迁移的效应被抑制。以上结果表明TIPE3对乳腺癌的作用是通过激活AKT和NF-κB信号实现的。2.6.2 TIPE3蛋白活化BF-κB信号通路降低乳腺癌细胞阿霉素敏感性过表达TIPE3促进阿霉素处理MCF-7细胞p-IcBα活化水平,而且MDR1/P-gp表达相应增加,当p-IκBα的活化被CAPE抑制后P-gp蛋白表达降低。表明TIPE3通过活化N-F-κB信号通路上调P-gp的表达,降低MCF-7细胞对阿霉素的敏感性。3.动物实验证实TIPE3蛋白促进乳灥癟生长和转移3.1 TIPE3促进裸鼠皮下肿瘤生长TIPE3组裸鼠皮下肿瘤瘤体的生长速度明显快于对照组。而且,TIPE3组最终的肿瘤体积和重量明显大于对照组。TIPE3组瘤体中TIPE3表达明显高于对照组。说明TIPE3促进裸鼠皮下肿瘤生长。3.2干扰TIPE3抑制裸鼠体内肿瘤发生肺转移肺转移模型结果显示,干扰TIPE3组乳腺癌细胞发生肺转移灶的大小和数量明显少于对照组,说明TIPE3促进乳腺肿瘤发生肺转移。结论1.TIPE3蛋白在乳腺浸润癌组织内的表达显著高于原位癌,在淋巴转移处癌组织内的表达显著高于未转移的原位癌和浸润癌,提示TIPE3表达上调与乳腺癌的恶性进展正相关。2.TIPE3在高侵袭性乳腺癌细胞系的表达高于低侵袭性癌,且与Her2表达水平呈正相关。3.细胞实验表明TIPE3通过激活AKT和NF-κB信号通路上调MMP-2和uPA表达促进乳腺癌的生长和转移。4.TIPE3通过激活NF-κB信号通路上调P-gp的表达,进而降低乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性。创新性和意义1.首次研究TIPE3分子在乳腺癌发生和浸润转移中的作用及其机制,研究中创新性的发现将为揭示乳腺癌的分子机制奠定良好的基础,为乳腺癌的诊断和治疗提供新的作用靶点。2.论文以临床标本检测、细胞实验、动物模型系统研究了 TIPE3在乳腺癌中的作用及机制,结果发现TIPE3通过激活AKT和NF-κB信号通路上调MMP-2和uPA的表达进而促进乳腺癌的生长和浸润转移。3.TIPE3能够通过活化NF-κB信号通路降低乳腺癌细胞化疗敏感性。TIPE3或许成为提高乳腺癌阿霉素敏感性的新的分子靶点。