背景:蟾酥是由蟾蜍科两栖爬行动物的耳后腺及皮肤腺分泌物经加工而成,是我国著名传统中药材。蟾蜍甾烯类化合物是中药蟾酥中的主要药效成分,是麝香保心丸、六神丸、六应丸等著名中药复方的重要活性成分,具有强心、局部麻醉抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性。随着蟾蜍甾烯类化合物抗肿瘤活性越来越受到重视,针对该类化合物的新药开发案例不断涌现。虽然蟾毒灵等蟾蜍甾烯类化合物对多种人源肿瘤细胞显现了极强的杀伤能力,该类化合物在活体内的药效活性并不令人满意,提示其成药性上可能存在缺陷。多方面信息证实,蟾蜍甾烯在人及实验动物中均会被快速代谢清除,严重影响其体内药效发挥。目前,蟾蜍甾烯类化合物的体内代谢研究时有报道,但绝大多数代谢研究均是基于实验动物开展的。然而,考虑到药物代谢酶等药物处置蛋白上普遍存在的显著种属间差异,这些信息及数据的可信程度仍值得商榷。时至今日,蟾蜍甾烯在人体内及不同种属实验动物体内的代谢路径,以及蟾蜍甾烯与其他药物间的代谢酶介导的潜在相互作用均尚未被很好的研究与揭示。目的:1)明确中药蟾酥中主要蟾蜍甾烯类化合物在人体内的主要代谢路径,关键代谢酶及动力学行为;从定性和定量两方面剖析蟾蜍甾烯取代基变异对其代谢酶选择性及代谢速率的影响。2)寻找蟾蜍甾烯代谢酶选择性及催化效率的关键决定因素,揭示清除的关键代谢酶以及结构代谢规律。3)系统开展蟾蜍甾烯类化合物的代谢种属间差异研究,从代谢角度分析及比较人与常用实验动物处置蟾蜍甾烯类化合物的相似性及差异性。4)开展蟾蜍甾烯-人体关键代谢酶细胞素色P450相互作用研究,分别明确蟾蜍甾烯代表性化合物蟾毒灵对细胞素色P450的抑制情况以及潜在共服药物对细胞素色P450介导的蟾毒灵代谢的影响效果。为蟾蜍甾烯类新药的研发以及含该类成分的中药复方在临床的安全合理使用提供研究基础和理论依据。方法:1)首先借助体外代谢研究手段,利用人源肝组织匀浆,以代表性蟾蜍甾烯为研究对象,开展的I相及II相代谢路径研究。经由代谢轮廓分析、代谢产物制备等研究手段对该类化合物的代谢物谱进行确证;经由特异性抑制剂抑制分析、相关性分析等对该类化合物的主要代谢酶进行归属;经由代谢动力学分析、清除半衰期等研究对该类化合物的代谢稳定性进行表征。2)此外,借助分子对接计算化学手段,揭示负责催化蟾蜍甾烯代谢的关键氨基酸及影响代谢过程的核心结构域。3)借助体外代谢抑制研究手段,分别开展蟾毒灵对细胞色素P450的抑制选择性、抑制能力(IC50)、抑制动力学及参数(Ki、KI、Kinact)、抑制机制研究,以及蟾毒灵共服药物对细胞色素P450介导的蟾毒灵代谢的抑制能力研究(IC50)。结果:一、蟾蜍甾烯体外代谢属性研究1)I相代谢研究:在前期对华蟾毒精I相代谢的基础上,分别对蟾毒灵、脂蟾毒配基、蟾毒它灵、日蟾毒它灵和沙蟾毒精的I相代谢路径开展了系统的研究。研究发现,在人肝微粒体中,上述蟾蜍甾烯均选择性被细胞色素P450 3As(包括CYP3A4和CYP3A5)催化代谢,主要分别生成1-羟基和5-羟基产物。然而,蟾蜍甾烯化合物间在代谢稳定性,以及与CYP3A4、CYP3A5的催化选择性、动力学参数上存在显著差异。2)蟾蜍甾烯结构-细胞色素P450 3As(CYP3As)关系研究:研究发现,蟾蜍甾烯与CYP3As的亲和力参数Km分别与该类化合物在人肝微粒体中的代谢稳定性以及与CYP3A5在I相代谢路径中的贡献具有一定的相关性。针对人肝微粒体中的动力学参数分析发现,人肝微粒体中Km值小的蟾蜍甾烯清除率则偏高,代谢稳定性较差。而针对人重组单酶CYP3A中Km分析发现,多种取代基的引入可不同程度的改变蟾蜍甾烯与CYP3A4和CYP3A5的亲和力,影响CYP3A4和CYP3A5在蟾蜍甾烯代谢中的贡献率。蟾蜍甾烯-I相代谢关系如下:11位羟基、12位酮基可增强与CYP3A5的亲和力,提升CYP3A5的催化选择性;16位乙酰基、19位醛基在降低与CYP3A4的亲和力同时增强与CYP3A5的亲和力,提升CYP3A5的催化选择性。3)II相代谢研究:分别对华蟾毒精、蟾毒灵、脂蟾毒配基、远华蟾毒精、去乙酰基华蟾毒精、蟾毒它灵的II相代谢路径开展了系统的研究。在人肝S9中,上述蟾蜍甾烯会选择性被磺酸转移酶2A1催化代谢,生成产物3-O-磺酸盐。不同蟾蜍甾烯的3位磺酸结合反应符合底物抑制动力学,但动力学参数Km、Ksi和Vmax等均变化显著。4)蟾蜍甾烯结构-磺酸转移酶2A1(SULT2A1)关系研究:研究结果揭示,蟾蜍甾烯3位羟基构型是决定该类化合物能否发生磺酸结合反应的关键,SULT2A1催化活性空腔中His99是负责识别蟾蜍甾烯类化合物的关键氨基酸残基。而蟾蜍甾烯在SULT2A1活性空腔中的构象与朝向,及其与His99间的能否形成相互作用等均是影响磺酸结合反应能否发生的关键因素。研究蟾蜍甾烯-II相代谢关系如下:亲水取代基(如C11、C14、C16位羟基)会显著削弱蟾蜍甾烯与SULT2A1的亲和力,而C5位羟基作为例外则会显著增强与SULT2A1的亲和力;C19位醛基会阻碍磺酸结合反应;C16位乙酰基会降低与SULT2A1的亲和力。二、蟾蜍甾烯体外代谢种属差异研究1)I相代谢种属差异研究:在多种动物肝微粒体中,蟾蜍甾烯类化合物蟾毒灵和脂蟾毒配基的代谢轮廓与人肝微粒体中较为相似。CYP3A亚家族是催化该反应的主要代谢酶。然而,不同种属间微粒体催化蟾毒灵和脂蟾毒配基代谢的动力学行为和动力学参数上显著差异。小型猪和小鼠肝微粒体催化蟾毒灵发生5位羟化反应的动力学行为及相关参数与人肝微粒体观察到的相关信息更为相近,而猴肝微粒体介导的脂蟾毒配基的5位羟化反应在动力学行为上与脂蟾毒配基在人肝微粒体中的代谢行为更为相近。猴肝微粒体催化5位单羟化产物生成的效率显著高于人肝微粒体和其他动物肝微粒体,小鼠肝微粒体中蟾毒灵和脂蟾毒配基5位羟化反应的清除率与人肝微粒体中对应的数值更为相近。2)II相代谢种属差异研究:在多种动物肝微粒体中,小鼠和狗S9缺少磺酸结合代谢路径,而在大鼠、兔、豚鼠、小型猪、猴S9中,蟾毒灵和脂蟾毒配基的代谢路径与人肝S9中一致。不同动物种属中SULT2A1是催化该反应的主要代谢酶。兔肝S9催化二者磺酸结合产物生成效率高,磺酸结合产物在肝S9间的体外代谢内在清除率顺序为兔或人>小型猪>豚鼠>猴>大鼠。三、蟾毒灵对细胞色素P450 3As的抑制作用研究1)蟾毒灵(BF)和其3位氧化代谢产物3-酮-蟾毒灵(KBF)是细胞色素P450 3As(CYP3As)的强选择性抑制剂,IC50值分别是10.4和0.22μM。抑制动力学研究提示BF和KBF对CYP3As的抑制均符合混合抑制模型,Ki分别为1.90和0.20μM。2)BF对CYP3A4的抑制作用存在基于时间的抑制情况,这种现象产生的原因与CYP3A4介导的KBF生成有关系,提示BF对CYP3A4的抑制作用属于自杀式抑制。不仅如此,KBF与人肝微粒体催化孵育30分钟后可进一步提高对CYP3A4的抑制作用,IC50值由0.37降低至0.036μM。BF和KBF对CYP3A4的失活呈现时间-和浓度-依赖的特性,并符合一级动力学过程。在人肝微粒体中,BF失活CYP3As的KI和Kinact分别为21.1μM和0.141 min-1;KBF失活CYP3As的KI和Kinact分别为0.66μM和0.064 min-1。在人CYP3A4重组单酶中,BF失活CYP3A4的KI和Kinact分别为1.13μM和0.097 min-1;KBF失活CYP3A4的KI和Kinact分别为0.25μM和0.161 min-1。3)通过清洗试验和保护剂保护实验对KBF介导的CYP3A4基于时间抑制作用的机制进行初步揭示。研究提示KBF可能通过代谢生成的高活性代谢产物而诱发对CYP3A4的不可逆抑制作用。抑制过程可能导致CYP3A4功能快速丧失而引发严重的药物药物相互作用,亦或导致蟾毒灵以及其结构类似物代谢受阻而诱发急慢性心脏毒、肝毒性以及其他难以预料的严重毒性反应。结论:1)细胞色素P450介导的羟化反应和磺酸转移酶介导的磺酸结合反应分别被鉴定为蟾蜍甾烯系列化合物在人体中代谢清除的I相和II相代谢路径。蟾蜍甾烯的5位和1位碳是该类化合物的主要羟化位点,催化这一代谢反应的代谢酶被归属为细胞色素P450 3As。此外,蟾蜍甾烯的3位羟基是该类化合物的主要磺酸结合位点,催化这一代谢反应的代谢酶被归属为磺酸转移酶2A1。而蟾蜍甾烯3位羟基构型是决定该类化合物能否发生磺酸结合反应的关键。2)蟾蜍甾烯类化合物结构母核上的取代基可显著影响自身与代谢酶的相互作用,因此,这类化合物在人体内的代谢行为和动力学参数千差万别。研究发现,蟾蜍甾烯结构母核上不同位点的取代基可显著影响蟾蜍甾烯与代谢酶CYP3As和SULT2A1的结合作用,集中体现于表观动力学参数Km值。蟾蜍甾烯-I相代谢关系研究提示,11位羟基、12位酮基可增强与CYP3A5的亲和力,提升CYP3A5的催化选择性;16位乙酰基、19位醛基在降低与CYP3A4的亲和力同时增强与CYP3A5的亲和力,提升CYP3A5的催化选择性。研究蟾蜍甾烯-II相代谢关系时发现:亲水取代基(如C11、C14、C16位羟基)会显著削弱蟾蜍甾烯与SULT2A1的亲和力,而C5位羟基作为例外则会显著增强与SULT2A1的亲和力;C19位醛基会阻碍磺酸结合反应;C16位乙酰基会降低与SULT2A1的亲和力。3)多种实验动物肝制备物中蟾蜍甾烯类化合物蟾毒灵和脂蟾毒配基的I相和II相代谢轮廓与人肝制备物中二者的代谢轮廓较为相似,但小鼠和狗肝S9缺少磺酸结合代谢路径。CYP3As和SULT2A1被分别鉴定为不同种属动物肝脏中介导蟾毒灵和脂蟾毒配基发生I相和II相代谢的主要代谢酶。然而,不同种属间肝脏制备物对蟾毒灵和脂蟾毒配基的催化效率间存在显著差异。4)蟾毒灵和其3位氧化代谢产物3-酮-蟾毒灵是CYP3A4的强选择性抑制剂。我们首次发现3-酮-蟾毒灵可能通过代谢生成的高活性代谢产物而诱发对CYP3A4的不可逆抑制作用。而正是在此过程中,CYP3A4由于介导蟾毒灵的代谢而引起了自身催化功能的丧失,属于自杀式抑制作用。因此,蟾毒灵及其代谢产物对CYP3A4的抑制作用不仅会影响蟾毒灵及其结构类似物的代谢,还可能通过灭活CYP3A4而干扰其他共服药物的代谢而导致严重的药物药物相互作用。