论文部分内容阅读
目的:阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）是一种常见的呼吸睡眠疾病,以反复上气道塌陷及慢性间歇低氧为主要特点。上气道的稳定开放主要依赖于上气道负压及神经肌肉调控的平衡,其中颏舌肌起着至关重要的作用。在健康人群中,颏舌肌通过舌下神经接受上游中枢神经系统的调控。这种调控作用已被证明可受到快动眼（Rapid Eye Movement,REM）期睡眠及低氧的影响。由于长期处于低氧状态,清醒时OSA患者的颏舌肌及其中枢调控常表现为代偿性的活性增加,以对抗上气道塌陷。但进入REM睡眠期后,这种代偿活性的消失将导致OSA患者的上气道较健康人群更容易塌陷,从而进一步加重病情,造成恶性循环。在睡眠期舌下神经核上的5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）与去甲肾上腺素均可影响舌下神经的活性,且去甲肾上腺素可能占到了作用的90%。本实验小组曾就此进行了一系列研究,来探讨在常氧及慢性间歇低氧条件下,中枢神经系统中的5-HT与去甲肾上腺素参与颏舌肌调控的潜在机制。我们发现,中缝核上的5-羟色胺能神经元可参与介导慢性间歇低氧诱导的颏舌肌运动皮层易化。向舌下神经核中微注射α1肾上腺素能受体阻断剂可使颏舌肌的经颅磁刺激（Transcranial magnetic stimulation,TMS）反应明显下降,提示我们去甲肾上腺素可通过舌下神经核上的α1受体为颏舌肌的中枢调控提供正向的去甲肾上腺素能驱动。而慢性间歇低氧可使这种驱动效应明显加强。以上结论均提示我们,慢性间歇低氧所介导的颏舌肌中枢调控中,去甲肾上腺素起到了非常重要的作用。中缝核上的5-HT能神经元通过激动舌下神经核上的5-HT2A受体来激活舌下神经及颏舌肌。我们由此猜测,舌下神经核上的去甲肾上腺素同样来源于上游去甲肾上腺素能神经元。并且此神经元同样可以参与慢性间歇低氧大鼠颏舌肌的中枢调控。解剖证据表明,舌下神经核上分布的去甲肾上腺素能纤维末梢主要来源于位于脑干A5、LC、A7等去甲肾上腺素能细胞群,其中A7具有最大的投射倾向及比例。细胞膜上可与去甲肾上腺素结合的受体称为肾上腺素能受体,属于G蛋白耦连受体。研究表明,A7去甲肾上腺能神经元上主要表达α2肾上腺素能受体。作为一种自身受体,α2肾上腺素能受体主要分布于突触前,可负反馈调节神经元去甲肾上腺素释放。G蛋白门控的内向整流钾通道（G protein-gated inwardly rectifying postassium,GIRK）在中枢神经系统中广泛分布,通常参与调解神经递质对突触后的抑制效应,可受去甲肾上腺素等多种神经递质的调控。免疫印迹实验结果表明,A7细胞群存在GIRK通道阳性表达。由此我们可提出假设,A7细胞群去甲肾上腺素能神经元可参与颏舌肌的中枢调控,可通过GIRK通道受神经元上的α2肾上腺素能受体（α2受体）调节。慢性间歇低氧已被证明可参与介导颏舌肌的中枢代偿。但去甲肾上腺素如何参与慢性间歇低氧大鼠的中枢调控,尚无明确定论。本研究课题旨在通过建立慢性间歇低氧模型大鼠来模拟临床OSA患者反复间歇低氧的特点。在低氧的不同时间点,通过观察大鼠颏舌肌肌电图（Electromyogram,EMG）、TMS反应及相关受体的变化等,来探讨慢性间隙低氧A7细胞群去甲肾上腺素能神经元对颏舌肌中枢调控的作用及机制,进而为OSA患者的临床诊断与治疗提供新的理论依据。方法:1.在常氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元及α2受体与GIRK通道对颏舌肌的中枢调控的影响。在本实验部分中,我们选取SPF级健康成年Wistar雄性大鼠,随机分为常氧组（NO组,n=8）、IgG-SAP给药组（IgG组,n=8）、Anti-DBH-SAP给药组（SAP组,n=8）、NACL给药组（NACL组,n=8）、Clonidine给药组（CLO组,n=8）、RS-79948给药组（RS组,n=8）、ML297给药组（ML组,n=8）、Tertiapin-Q给药组（TER组,n=8）、Tertiapin-Q/Clonidine给药组（TC组,n=8）与ML297/RS-79948给药组（MR组,n=8）。参考既往文献,通过免疫组化及免疫荧光明确去甲肾上腺素能神经元在脑中的分布,利用琼脂糖凝胶模型模拟药物在脑内的扩散,通过脑立体定位仪进行A7细胞群去甲肾上腺素能神经元定位。将特异性去甲肾上腺素能神经元损伤剂Anti-DBH-SAP、α2受体激动剂Clonidine、α2受体阻断剂RS-79948、GIRK通道激动剂ML297与GIRK通道阻断剂Tertiapin-Q分别微量注射入相应实验组大鼠的A7细胞群。另有实验大鼠被分别给予同等剂量IgG-SAP或NACL作为对照组。待大鼠恢复后,应用经颅磁刺激在特定时间点测量颏舌肌的TMS与EMG结果,来验证常氧条件下A7去甲肾上腺能神经元及α2受体与GIRK通道对大鼠颏舌肌中枢调控的影响。2.慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元及α2受体对颏舌肌的中枢调控的影响及可能机制探讨。在本实验部分中,我们选取SPF级健康成年Wistar雄性大鼠,建立慢性间歇低氧（Chronic Intermittent Hypoxia,CIH）模型。实验大鼠每天于8:00 AM-4:00 PM置于低氧舱共8小时,以7天为一周期,持续4个周期共28天。每次缺氧-复氧循环时间为188s,舱内氧浓度呈周期波动于10%至21%之间。慢性间歇低氧大鼠被随机分为单纯慢性间歇低氧组（CIH组,n=32）、IgG-SAP给药组（CIH+IgG组,n=8）、Anti-DBH-SAP给药组（CIH+SAP组,n=8）、Clonidine给药组（CIH+CLO组,n=8）、RS-79948给药组（CIH+RS组,n=8）、NACL给药组（CIH+NACL组,n=8）。参考既往文献,通过立体定位技术,将特异性去甲肾上腺素能神经元损伤剂Anti-DBH-SAP注射入CIH-SAP组大鼠的A7细胞群。α2受体激动剂Clonidine、α2受体阻断剂RS-79948在实验进行当天被分别注射进入CIH-CLO与CIH-RS组大鼠的A7细胞群。另有实验大鼠被分别给予同等剂量IgG-SAP或NACL作为对照组。待大鼠恢复后,在每一低氧周期结束当天,即低氧的第7、14、21、28天,应用经颅磁刺激在特定时间点测量颏舌肌的TMS与EMG结果,来验证慢性间歇低氧条件下A7细胞群去甲肾上腺能神经元及其上α2受体对大鼠颏舌肌中枢调控的影响。另有CIH组大鼠在每一低氧周期结束当天被处死,进行脑组织灌流取材及标本切片,进行冰冻切片免疫组化。比较低氧不同时间点A7细胞群去甲肾上腺素能神经元多巴胺-β-羟化酶（Dopamineβ-hydroxylase,DBH）、舌下神经核去甲肾上腺素能纤维末梢、α1受体及α2受体蛋白的表达情况。以此来探讨慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元对颏舌肌的中枢调控影响的可能机制。结果:1.在常氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元及α2受体与GIRK通道对颏舌肌的中枢调控的影响1.1在常氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元参与了颏舌肌的中枢调控,并起正向调控作用。当损伤A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元时,可导致颏舌肌EMG活性下降,TMS潜伏期变长且振幅下降（p<0.05）。1.2在常氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元上的α2受体参与了颏舌肌的中枢调控,并起负向调控作用。当激动A7细胞群α2受体时,可导致颏舌肌EMG活性下降,TMS潜伏期变长且振幅下降。反之亦然（p<0.05）。1.3在常氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元上的GIRK通道参与了颏舌肌的中枢调控,并起负向调控作用。当激动A7细胞群GIRK通道时,可导致颏舌肌EMG活性下降,TMS潜伏期变长且振幅下降。反之亦然（p<0.05）。1.4在常氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元α2受体对颏舌肌中枢调控的功能是与GIRK通道耦联的（p<0.05）。2.慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元及α2受体对颏舌肌的中枢调控的影响及可能机制探讨2.1在慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元参与了颏舌肌的中枢调控,并起正向调控作用。这种正向调控作用持续28天。当损伤A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元时,可导致颏舌肌TMS潜伏期变长且振幅下降,EMG活性下降（p<0.05）。2.2在慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元上的α2受体参与了颏舌肌的中枢调控,并起负向调控作用。这种负向调控作用持续28天。当激动A7细胞群α2受体时,可导致颏舌肌TMS潜伏期变长且振幅下降,EMG活性下降。反之亦然（p<0.05）。2.3慢性间歇低氧可增加A7细胞群去甲肾上腺素能神经元的DBH表达平均光密度值（p<0.05）,未影响DBH阳性细胞数目（p>0.05）。2.4慢性间歇低氧增加了去甲肾上腺素能纤维膨体末梢数目（p<0.05）,但未影响舌下神经核上去甲肾上腺素能纤维末梢DBH的表达的平均光密度值p>0.05)。2.5慢性间歇低氧可增加舌下神经核的α1A受体表达的平均光密度值（p<0.05）,但未影响阳性细胞数目（p>0.05）。2.6慢性间歇低氧可减少舌下神经核的α2A受体表达的平均光密度值（p<0.05）,但未影响阳性细胞数目（p>0.05）。结论:1.在常氧条件下,A7细胞群去甲肾上腺素能神经元通过α2受体与GIRK通道参与颏舌肌的中枢调控。2.在慢性间歇低氧条件下,A7细胞群去甲肾上腺素能神经元正向参与颏舌肌的中枢调控,作用持续28天。3.慢性间歇低氧影响A7细胞群DBH、舌下神经核去甲肾上腺素能纤维末梢、α1A受体及α2A受体的表达。