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产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是引起婴幼儿和幼畜腹泻的主要病原体之一,感染者常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,给人类的健康和养殖业都带来了极大的危害。ETEC的主要毒力因子包括肠毒素、黏附素、志贺毒素、溶血素和内毒素等,其中引起腹泻的主要是具有宿主特异性的黏附素和肠毒素。肠毒素根据热稳定性分为不耐热肠毒素(Heat-labile toxin, LT)和耐热肠毒素(Heat-stable toxin, ST)两类,现有的检测方法分别是兔肠袢结扎试验和乳鼠灌胃试验,不利于肠毒素的快速检测。因此,开展肠毒素单克隆抗体和抗原表位的研究,对肠毒素快速检测方法的建立、致病机理研究和表位疫苗的开发具有重要的理论和实际意义。本研究以LT为研究对象,开展了LT B亚单位多克隆抗体(PAb)制备、单克隆抗体(MAb)制备和B细胞线性抗原表位的分析。抗LTB多克隆抗体的制备。本研究将质粒pET-30a-LTB转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,构建了重组大肠杆菌Rosetta/pET-30a-LTB,诱导表达后获得了重组蛋白LTB (18ku)。以纯化的重组蛋白LTB为免疫原免疫新西兰白兔,制备了抗LTB多克隆抗体。间接ELISA检测结果显示,经3次免疫后,血清抗体效价可达1：1×218。单克隆抗体的制备。用纯化的重组蛋白LTB免疫8周龄的雌性BALB/C鼠,待血清抗体效价符合要求后,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选,获得3株能稳定分泌抗重组蛋白LTB单克隆抗体的阳性细胞,分别命名为B1、D5和H10,其所分泌的单克隆抗体分别命名为MAb B1、MAb D5和MAb H10。染色体鉴定结果证明,3株阳性细胞符合杂交瘤细胞染色体特性。间接ELISA检测结果显示,B1、D5和H10培养物上清中MAb B1、MAb D5和MAb H10效价分别为1：1×29、1：1×210和1：1×210；MAb B1、MAb D5和MAb H10亚类分别为IgG2b、IgG2b和IgG1；用B1、D5和H10制备的小鼠腹水中MAb B1、 MAb D5和MAb H10效价分别为1：1.28×105、1：1.28×105和1：2.56×105。阻断ELISA检测结果显示,只有MAb D5能与天然LT毒素反应。Western blot检测结果证明,MAb D5能与天然LT反应,且不与ST (STa、STb)和Stx (Stx1、Stx2、Stx2e)反应,具有良好的特异性。细胞中和试验结果证明,MAb D5能中和天然LT对Y1细胞的毒性作用,中和效价为1：50。LTB亚单位B细胞线性抗原表位分析。本研究设计并表达了10个覆盖整个LTB蛋白的重组多肽片段。Western blot分析证明,LT B亚单位B细胞线性抗原表位位于1-26aa、41-76aa和81-103aa区域。MAb D5识别的抗原表位区域是61-76aa,即61QKKAIERMKDTLRITY76,此表位为中和表位。综上所述,本研究获得的MAb D5能与重组蛋白LTB和天然LT反应,具有良好的特异性和对LT的中和作用,为LT的检测提供了有效的试剂：MAb D5识别的抗原表位的发现,为建立基于抗原表位的快速诊断方法和研制表位疫苗奠定了基础。