玉米(Zea mays)是世界上重要的粮食作物。玉米花粉的发育是否正常直接影响受精作用的进行和玉米产量。ZmSTK是玉米花粉中特异性表达的胞质类受体蛋白激酶基因,在花粉发育过程中起关键作用。本课题组已经证明ZmSTK与ZmENO互作,当ZmSTK功能缺失时导致烯醇化酶活力下降,进而影响玉米花粉发育。ZmENO1和ZmENO2是玉米烯醇化酶,由于烯醇化酶是糖酵解途径中的关键酶,其失活影响了玉米的发育,说明烯醇化酶参与了玉米花粉发育的调控。因此,为了进一步阐明ZmSTK-烯醇化酶调控玉米花粉发育的机制,本研究对烯醇化酶在不同物种中的进化、表达、蛋白定位进行了分析。通过基因编辑技术构建了ZmENOs基因敲除玉米,并对基因敲除植株的表型进行了初步观察。(1)通过构建系统进化树预测烯醇化酶进化的保守型以及各物种烯醇化酶进化关系。其次,对烯醇化酶的蛋白质二级结构进行预测,结果发现二级结构十分相似,三级结构略有差异,但大体上相近。此外,通过对各物种烯醇化酶的内含子进行统计比较分析发现,不论是在内含子的数量还是位点方面差距都很小,暗示着他们密切的进化关系。烯醇化酶激酶特异性磷酸化位点分析结果显示,激酶域序列包含丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)三种磷酸化位点,丝氨酸的数量最多并且相似度很高。大多数物种Ka/Ks比值都大于1,说明烯醇化酶在进化上主要受正选择影响。(2)ZmENO1和ZmENO2的表达模式分析结果表明,两基因在玉米各个组织均有表达,除叶片与雌蕊两个基因的表达量有差异外,其余组织表达量相同。ZmENO1和ZmENO2蛋白均定位在细胞质中,与糖酵解途径在细胞质中进行的结论相一致。(3)通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建pSUPER1300-ZmENO1和pSUPER1300-ZmENO2载体,运用农杆菌介导的萌动胚转化法将载体转入野生型(MCC)玉米的种子内,经过除草剂筛选以及BAR基因的PCR检测获得了12棵阳性植株,并收获了T0代种子。通过初步观察表型我们发现基因敲除植株长势矮小,花粉发育异常,花粉量减少。这些工作将为后续探究ZmSTK-ZmENOs对花粉发育的调控机理奠定基础。