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研究目的厚朴麻黄汤为中医药经典名方之一,梳理厚朴麻黄汤的功效、主治、组成药物的基原、炮制及剂量、煎服法,为认识和应用厚朴麻黄汤及其复方制剂研发提供参考。环境污染物是哮喘常见的诱发因素,以环境污染物SO2衍生物（Sulfur dioxide derivative,SDD）为刺激、加重因素,通过体内外实验研究,探讨SDD对哮喘的加重作用及机制。以厚朴麻黄汤及拆方干预环境污染物SDD加重OVA诱导哮喘,并以体外实验研究,结合代谢组学,探讨厚朴麻黄汤及拆方对此类哮喘的作用效应及机制特点,为厚朴麻黄汤的临床使用提供理论依据。研究方法1.收集整理历代有关厚朴麻黄汤的相关记载及论述,梳理厚朴麻黄汤源流、功用、主治及煎服方法;同时收集整理历代本草、医籍中有本方药物的记载及论述,结合古今度量衡考证、实物测量及《伤寒论》中功效相近的方剂中药物用量,分析厚朴麻黄汤中药物的基原、炮制、用量及本方的煎服法。2.以SDD气道滴注复合OVA,复制环境污染物SDD加重OVA诱导哮喘的模型,比较不同实验周期及干预剂量下,大鼠外周血嗜酸性粒细胞（eosinophil,EOS）总数、支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF）中白细胞总数（White Blood Cell,WBC）及各类炎细胞的百分比,检测大鼠脾淋巴细胞的分化、比较大鼠气道反应性及肺组织病理损伤的差异,采用ELISA检测各组大鼠BALF中相关炎症因子的水平,Western blotting（WB）、定量聚合酶链反应法（qPCR）检测大鼠肺组织中瞬时受体电位（transient receptor potential,TRP）阳离子通道香草酸（vanilloid,V）亚家族成员1（TRPV1）、紧密连接蛋白（Tight junctions,TJs）ZO-1,Occludin,Claudin-3 蛋白表达的影响,探讨 SDD 对OVA诱导哮喘的加重作用及机制。3.采用SDD复合OVA干预野生型（Wild Type,WT）小鼠及TRPV1基因敲除（TRPV1-/-）小鼠,观察比较两组小鼠在炎症反应、气道反应性、肺组织病理损伤及肺组织中TRPV1、TJs蛋白表达的差异,分析此类哮喘中TRPV1对TJs变化的影响;体外实验采用SDD复合 Interleukin（IL）-4 干预人支气管上皮细胞（Humanbronchial epithelial,16HBE）,检测干预后细胞TRPV1、TJs表达的改变,钙成像检测细胞内钙离子浓度变化,及TRPV1受体拮抗剂AMG9810干预后TJs蛋白的表达及形态变化。4.采用厚朴麻黄汤对SDD加重OVA诱导哮喘的大鼠进行药物干预,观察比较厚朴麻黄汤干预对大鼠炎症反应、肺功能、肺组织病理损伤的作用,检测比较其对肺组织中TRPV1、TJs表达的影响。采用多重拆方的方法对厚朴麻黄汤进行拆方研究:从药物功效角度拆分为:拆方1（Chai-1,去宣）:厚朴、石膏、半夏、杏仁、五味子、小麦;拆方2（Chai-2,去肃）:麻黄、干姜、细辛、小麦;从组方衍化角度拆分为:拆方3（Chai-3,宣降清肺）:厚朴、麻黄、杏仁、石膏;拆方4（Chai-4,化饮理肺）:半夏、干姜、细辛、五味子对SDD加重OVA诱导哮喘大鼠进行干预,比较厚朴麻黄汤各组成部分对此类哮喘大鼠炎症反应、肺功能、肺组织病理损伤、TRPV1、TJs蛋白表达的影响。体外实验采用SDD复合IL-4干预及TRPV1靶向沉默16HBE细胞,以厚朴麻黄汤进行药物干预,检测厚朴麻黄汤及拆方干预后细胞的存活率、细胞内Ca2+浓度及细胞中的TRPV1、TJs蛋白表达,探讨厚朴麻黄汤经TRPV1对细胞的保护作用及可能机制。5.采用代谢组学的研究方法检测大鼠血清代谢变化,分析此类哮喘的代谢特点及厚朴麻黄汤干预此类哮喘的代谢组学改变。研究结果1.厚朴麻黄汤具有宣肺化饮,清肺化痰,降气平喘的功效,主治寒饮内停,挟热迫肺所致的咳、胸满、喉中不利如水鸡声、脉浮,方中共有9味药物,其中厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.干皮、根皮及枝皮的干燥生品;麻黄为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf.草质茎的干燥生品;石膏为硫酸盐类石膏族矿物石膏Gypsum Fibrosum;杏仁为蔷薇科植物山杏（苦杏）Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.的种子,炮制方法为燀杏仁;半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.燥块茎的干燥生品;干姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的根茎干燥生品;细辛为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag.根的干燥生品;小麦为禾本科小麦属植物小麦Triticum aestivum L.种子的干燥生品;五味子为木兰科植物北五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.果实的碎干燥生品。厚朴麻黄汤中以衡器计量的药物为厚朴、麻黄、干姜、细辛;方中以量器计量的药物有半夏、杏仁、五味子、小麦,结合历代药物用量记载衍变及医家临床实际用量,方中厚朴:麻黄:杏仁:石膏:半夏:干姜:细辛:五味子:小麦（5:4:3:8:3:2:2:2:10）,厚朴用量约为15～18 g,其他药物可按此进行换算。煎服法为以2400 mL水先煮小麦熟,去滓,加入其余药物,煮至600 mL,分3次温服,每次200mL。2.环境污染物SDD暴露可加重OVA诱导大小鼠的哮喘,增加外周血EOS数量（P＜0.05,P＜0.01）,增加BALF中WBC数量及EOS、中性粒细胞（neutrophil,NEU）百分比（P＜0.05,P＜0.01）,增加脾淋巴细胞Th2、Th17细胞的分化（P＜0.05）,升高BALF中IL-4、IL-13水平（P＜0.05,P＜0.01）,加重气道高反应性及肺组织病理损伤;增高TRPV1基因及蛋白表达,降低ZO-1、Occludin、Claudin-3基因及蛋白表达。与WT小鼠比较,TRPV1-/-小鼠各组间外周血EOS数量,BALF中WBC总数、EOS及NEU百分比无明显改变;气道高反应性及肺组织病理损伤较轻,且TJs表达无明显差异。3.体外实验结果表明,SDD复合IL-4刺激可增高16HBE细胞的TRPV1蛋白表达（P＜0.05）,升高细胞内Ca2+的浓度（P＜0.01）,降低ZO-1、Occludin、Claudin-3蛋白的表达（P＜0.05）,破坏TJs的完整性及连续性;TRPV1受体拮抗剂干预后,16HBE细胞ZO-1、Occludin、Claudin-3 蛋白无显著改变（P＜0.05,P＜0.01）。4.厚朴麻黄汤可降低环境污染物SDD暴露加重OVA诱导哮喘大鼠的外周血EOS（P＜0.01）,BALF 中 WBC 总数（P＜0.05,P＜0.01）及 EOS、NEU 百分比（P＜0.05,P＜0.01）,减低大鼠的气道反应性（P＜0.05,P＜0.01）,减轻肺组织病理损伤,降低BALF中IL-4,IL-13水平（P＜0.01）,降低TRPV1基因及蛋白的表达（P＜0.05,P＜0.01）,回调ZO-1,Occludin,Claudin-3基因及蛋白的表达（P＜0.05,P＜0.01）。体外实验结果表明,厚朴麻黄汤可回调SDD复合IL-4导致的TRPV1表达的增高（P＜0.05,P＜0.01）,降低细胞内Ca2+的浓度（P＜0.05,P＜0.01）,回调TJs相关蛋白的表达（P＜0.05,P＜0.01）;且SDD复合IL-4刺激TRPV1靶向沉默16HBE细胞的TJs相关蛋白表达无明显改变。5.厚朴麻黄汤拆方可降低哮喘大鼠的外周血EOS数量（P＜0.05,P＜0.01）,BALF中WBC总数及EOS、NEU百分比（P＜0.05,P＜0.01）,缓解气道高反应性,减轻肺组织病理损伤,回调大鼠肺组织TJs相关蛋白的表达（P＜0.05,P＜0.01）;同时可回调SDD复合IL-4刺激的16HBE细胞TJs相关蛋白,保护TJs的连续性和完整性。其中Chai-1（去宣）组、Chai-3（宣降清肺）组缓解气道炎症效应较优;Chai-2（去肃）、Chai-1（去宣）、Chai-3（宣降清肺）组在缓解气道高反应性与肺组织病理损伤效优;Chai-3（宣降清肺）、Chai-4（化饮理肺）组缓解TRPV1效优,Chai-2（去肃）、Chai-4（化饮理肺）组回调TJs效优。体外实验结果显示各拆方组在调节TJs中效果不如全方组,其中Chai-2（去肃）、Chai-4（化饮理肺）组在回调TJs中效优。6.大鼠血清代谢分析结果显示厚朴麻黄汤参与多种代谢产物如氨基酸类、脂肪酸类、有机酸、鞘脂类等的代谢过程,如精氨酸、甘氨酸、花生四烯酸代谢、组氨酸、二氢鞘氨醇、鞘氨醇等,与气道炎症、气道高反应性、气道重塑等相关,部分差异代谢产物参与通路与TJs及Ca2+相关。研究结论1.厚朴麻黄汤功效为宣肺化饮,清肺化痰,降气平喘,主治为寒饮内停,挟热迫肺所致的咳、胸满、喉中不利如水鸡声、脉浮,方中药物用量比约为:厚朴:麻黄:杏仁:石膏:半夏:干姜:细辛:五味子:小麦（5:4:3:8:3:2:2:2:10）,厚朴用量约为15～18 g,其他药物可按此进行换算。煎服法为以2400 mL水先煮小麦熟,去滓,加入其余药物,煮一次至600 mL,每次200 mL,分3次温服。2.环境污染物SDD可加重OVA诱导哮喘,其浓度增加作用更为严重;而长期暴露,即使是低剂量,也会导致哮喘的加重。SDD暴露后,ZO-1、Occludin、Claudin-3表达下降,TRPV1表达增加,胞内Ca2+浓度增加;TRPV1受体拮抗剂可回调TJs蛋白的表达,故SDD加重OVA诱导哮喘及TJs破坏的机制可能与调节TRPV1/TJs蛋白表达有关。3.厚朴麻黄汤拆方可改善环境污染物SDD加重OVA诱导哮喘大鼠炎症反应、气道高反应性、肺组织病理损伤,降低TRPV1表达,调节ZO-1,Occludin,Claudin-3的表达;同时可升高16HBE细胞的存活率,降低细胞内Ca2+浓度,回调TJs蛋白的表达。全方功效优于拆方组,且各拆方组在抑制炎症、保护肺功能、回调TRPV1及TJs中发挥协同增效的功效。4.厚朴麻黄汤可参与多个代谢产物的代谢过程,其参与的鞘脂信号通路代谢、花生四烯酸代谢、组氨酸代谢等代谢通路,与细胞内Ca2+浓度、TRP通道及TJs相关。