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第一部分MiR-93通过靶向E2F1和CCND1抑制三阴性乳腺癌的生长和化疗耐药乳腺癌在全球女性癌症中发病率和死亡率均居首位,严重危害女性健康。化学疗法（简称化疗）是乳腺癌全身治疗的基石,但是在临床实践中化疗耐药通常会导致治疗失败。研究表明,microRNA（miRNAs）在转录后水平调节其下游靶基因的表达,广泛参与到包括癌症在内的多种疾病的生物学过程中。并且,miRNA的异常表达与癌症的发生发展密切相关。然而,目前有关miRNA参与化疗耐药的分子机制尚未阐明。髓样乳腺癌是三阴性乳腺癌的一种特殊组织类型,通常以化疗为主要的治疗手段。截至目前,关于髓样乳腺癌化疗耐药方面的研究甚少。本实验室前期对髓样乳腺癌亲代细胞和多药耐药细胞进行了高通量测序,并且建立了多药耐药相关的miRNA文库。本研究从该miRNA文库中筛选出了可以有效降低细胞耐药性的miRNA分子:miR-93-5p（miR-93）。首先,我们对miR-93的表达量进行了检测,结果显示miR-93在乳腺癌耐药细胞和临床乳腺癌组织中显著下调。通过MTT实验,我们发现过表达miR-93显著抑制乳腺癌细胞的增殖以及细胞对紫杉醇等多种化疗药物的耐药性,敲降miR-93则促进细胞增殖和紫杉醇耐药。此外,流式细胞实验结果显示,过表达miR-93可诱导G1/S期细胞周期停滞并促进细胞凋亡,而敲降miR-93则加快细胞周期进展且减少细胞凋亡。通过裸鼠皮下成瘤实验,我们发现miR-93显著抑制肿瘤的生长,尤其在与紫杉醇联合使用时,对肿瘤生长的抑制作用更明显。这些结果表明了miR-93可以降低乳腺癌对紫杉醇的抵抗性。接下来,我们运用Target Scan数据库对miR-93的下游靶基因进行了预测,并结合TCGA数据库对预测靶基因进行了筛选。通过qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶报告基因等实验,我们发现miR-93显著下调E2F转录因子1（E2F1）和细胞周期蛋白D1（CCND1）的表达,并且确定了miR-93直接靶向于E2F1和CCND1。此外,我们还发现过表达E2F1和CCND1明显促进细胞的增殖并提高细胞对紫杉醇的耐药性,而敲降E2F1和CCND1后细胞增殖和紫杉醇耐药显著受到抑制。流式细胞术检测结果显示,过表达E2F1和CCND1可以拮抗miR-93介导的细胞周期停滞和凋亡增加。以上结果说明了E2F1和CCND1是miR-93的双靶点,并且显著促进细胞增殖和紫杉醇耐药。进一步机制研究表明,miR-93通过下调E2F1和CCND1的表达,一方面降低RBE2F通路中重要蛋白和细胞周期相关蛋白的表达,从而抑制细胞增殖和细胞周期进展;另一方面减少AKT磷酸化并调控凋亡相关蛋白的表达,从而促进细胞凋亡。以上结果阐明了miR-93通过抑制E2F1和CCND1调控乳腺癌细胞耐药性的作用机制。总之,本课题发现miR-93双靶向E2F1和CCND1并下调它们的表达,显著抑制了乳腺癌的生长和化疗耐药。这些研究结果不仅可以为乳腺癌患者提供潜在的治疗靶点,还可以为今后化疗耐药逆转剂的开发提供新思路。第二部分探索与三阴性乳腺癌预后特异相关的差异表达miRNAs三阴性乳腺癌是最为凶险的一种乳腺癌分子分型,由于缺乏早期诊断标志物和有效治疗靶点,患者的预后通常较差。MicroRNAs（MiRNAs）在癌症中具有广泛的生物学功能,可作为理想的生物标志物。本研究旨在筛选出与三阴性乳腺癌预后特异相关的差异表达miRNAs（DEmiRNAs）。通过对目前最大的癌症基因图谱TCGA数据库的分析,我们筛选出了4个候选miRNAs,分别是miR-135b-5p,miR-9-3p,miR-135b-3p和miR-455-5p。它们在三阴性乳腺癌和癌旁正常样本之间差异表达,而在非三阴性乳腺癌和癌旁正常样本之间不差异表达。并且,这4个候选miRNAs与三阴性乳腺癌患者的预后特异相关,其中miR-135b-5p,miR-9-3p和miR-135b-3p高表达提示预后好,而miR-455-5p高表达提示预后差;且它们均与非三阴性乳腺癌患者的预后不相关。通过MTT和克隆形成实验,我们发现过表达miR-135b-5p,miR-9-3p和miR-135b-3p显著抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和克隆形成能力,过表达miR-455-5p则促进细胞的增殖和克隆形成。此外,细胞划痕和Transwell实验结果显示,过表达miR-135b-5p,miR-9-3p和miR-135b-3p,以及敲降miR-455-5p都明显减弱了三阴性乳腺癌细胞的迁移能力。以上结果表明这4个候选miRNAs与三阴性乳腺癌细胞的增殖和迁移密切相关。加权共表达网络分析（WGCNA）是一种探索基因模块和关注的表型之间相关性的生信方法,还可以进一步挖掘基因模块中的核心基因。首先,我们运用Target Scan数据库对以上miRNAs的下游靶基因进行了预测。接着,对预测靶基因进行了WGCNA分析,结果在高表达预后好的miRNAs（miR-135b-5p,miR-9-3p和miR-135b-3p）的潜在靶基因中确定了4个与三阴性乳腺癌分型高度正相关的核心基因,分别是FOXC1,BCL11A,FAM171A1和RGMA。随后,我们利用双荧光素酶报告基因等实验对miRNA-核心基因之间的靶向关系进行了鉴定,结果显示FOXC1和FAM171A1是miR-9-3p的直接靶标,RGMA是miR-135b-3p的直接靶标。鉴于FOXC1,FAM171A1和RGMA在三阴性乳腺癌细胞中高表达,我们通过siRNA分别敲降这3个基因,结果显示细胞的增殖和迁移均明显受到抑制。总之,本课题筛选了4个与三阴性乳腺癌预后特异相关的差异表达miRNAs（miR-135b-5p,miR-9-3p,miR-135b-3p和miR-455-5p）;鉴定了4个与三阴性乳腺癌分型高度正相关的核心基因（FOXC1,BCL11A,FAM171A1和RGMA）;验证了miR-9-3p和FOXC1、FAM171A1之间,miR-135b-3p和RGMA之间存在直接靶向关系;明确了以上分子对三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的作用。这些研究结果可以为开发三阴性乳腺癌患者特异的预后标志物和潜在的治疗靶点提供思路。