目的：脂质在肾脏细胞内沉积，是许多肾脏疾病的常见病理变化，脂质沉积造成细胞功能受损即所谓的“脂毒性（lipotoxicity）”。在蛋白尿（proteinuria)肾病中，脂毒性在肾小管间质损伤过程中发挥重要作用，且与肾病预后相关。游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs），在血液中与白蛋白结合，通过肾小球滤过膜被近端小管重吸收，FFAs是蛋白尿性肾病小管损伤的一种重要介质。肝型脂肪酸结合蛋白（liver-type fatty acidbinding protein， L-FABP/FABP1)是脂肪酸结合蛋白(fatty acid-bindingprotein，FABP)家族的成员之一，主要在人肝脏、小肠、肾脏及胰腺组织中表达，参与胞内脂肪酸的摄取、转运和代谢调节。在慢性肾脏疾病的研究中发现，尿中L-FABP水平与肾小管间质损伤的严重程度密切相关，已证实当大量蛋白尿时，是FFAs而不是白蛋白引起肾小管损伤。但FFAs对肾小管损伤的具体机制尚不清楚。内质网（endoplasmic reticulum,ER)是蛋白质合成、折叠和转运的重要细胞器，是细胞应对各种应激进行信息整合的中心。ER为了适应正在改变的环境而形成了一个未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）的信号途径，通过增强内质网的降解功能使蛋白质生物合成减少，来减轻内质网负担，维持细胞内稳态，增强细胞适应性，及时有效的逆转内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），但持续或过强的UPR将最终导致细胞凋亡。FFAs可通过ERS引起胰岛β细胞和肝细胞凋亡；大量蛋白尿时白蛋白可引起肾小管上皮细胞ERS。但有关FFAs是否通过ERS导致肾脏固有细胞凋亡的研究尚不多见。L-FABP作为FFAs的一个转运体，并与其进行可逆性结合完成跨膜转运至内质网、线粒体等细胞器。我们推测过多的FFAs转运至内质网引起ERS及小管细胞凋亡和转分化。本文将试图通过对培养的人近端小管细胞系（HK-2cells）的研究，用人体血液含量最高的FFAs—油酸（oleicacids，OA），一种18碳单不饱和脂肪酸作为FFAs的代表，探讨FFAs对肾小管损伤的机制。方法：人近端小管上皮细胞(HK-2)购自中国科学院上海细胞所。用含有10%胎牛血清，2mmol/l-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM-F12培养基培养细胞，用5%CO2，37℃的培养箱常规培养。待HK-2达80%~90%融合后，用无血清培养基同步细胞24h。细胞分组如下：正常对照组，油酸组和无游离脂肪酸白蛋白组（以下简称为白蛋白组）。1MTT法检测不同浓度、不同时间点油酸和白蛋白的生长曲线，确定HK-250%生存率时的浓度及时间点；2细胞常规爬片，扫描电镜观察干预12h时HK-2细胞超微形态改变；收集干预12h HK-2细胞，透射电镜观察细胞超微结构改变；3细胞常规爬片，原位末端转移酶标记技术（terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL）检测干预12h时HK-2细胞凋亡率；4提取6h、12h、24h不同干预条件下HK-2细胞蛋白，Western Blot检测L-FABP、GRP78、GADD153/CHOP、α-SMA、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的蛋白表达情况。结果：1干预12h, HK-2细胞的50%生存率的油酸浓度是100μmol/l，而无游离脂肪酸的白蛋白浓度是10mg/ml。2不同干预条件下12h时HK-2细胞超微结构改变⑴扫描电镜观察，正常对照组HK-2细胞间连接紧密，细胞膜菲薄细胞核位于中央，核仁明显，细胞器围绕细胞核周围；与正常对照组相比无游离脂肪酸白蛋白组细胞皱缩，但细胞膜完好，细胞外形呈荷叶状或轮辐状；而油酸组细胞体积缩小胞膜皱缩，细胞连接松散，细胞膜有破损，成筛孔状，出现核裂孔，胞质内容物明显增多，有的细胞器裸露。⑵透射电镜观察，正常对照组HK-2细胞发育良好，与正常对照组相比无游离脂肪酸白蛋白组细胞细胞器丰富；油酸组细胞膜破坏崩解，细胞微绒毛脱落，线粒体、内质网肿胀，胞浆中可见脂滴和糖原颗粒，并有散在的微丝存在。染色质浓染、边集化，细胞核呈锐角突起出现了凋亡的早期表现。3不同时间点油酸干预下HK-2细胞L-FABP蛋白的表达油酸干预HK-2细胞1h、3h、6h、12h和24h后，细胞总蛋白WesternBlot结果显示:6h开始表达上调，12h达到峰值，24h表达有所减低。4不同干预条件下内质网应激相关蛋白的表达细胞总蛋白Western Blot结果显示：细胞干预6h、12h和24h，三个时间点高油酸组和高白蛋白组GRP78和GADD/CHOP表达均高于正常对照组；而高油酸组表达又高于高白蛋白组。5油酸对HK-2细胞凋亡的影响⑴TUNEL检测表明12h时油酸组凋亡细胞率显著高于正常对照组和白蛋白组，正常对照组与白蛋白组间没有差别；⑵Western Blot结果：干预6h、12h和24h的HK-2细胞，油酸组Caspase-3和Cleaved Caspase-3比正常对照组和白蛋白组表达增加，且油酸组Bax/Bcl-2比率较其他两组高，正常对照组与白蛋白组相比差异无统计学意义。6油酸对HK-2细胞转分化的影响干预12h的HK-2细胞，油酸组α-SMA表达较正常对照组和白蛋白组表达增加，而正常对照组与白蛋白组间无差别。结论：1油酸可以上调HK-2细胞L-FABP蛋白和ERS相关蛋白GRP78、GADD/CHOP的表达，L-FABP的上调先于ERS相关蛋白的上调。我们推测油酸通过L-FABP诱发ERS，并激活ERS相关的凋亡通路。2油酸还可以上调Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白，使Bax/Bcl-2比值增加。荧光TUNEL染色证实OA干预引起细胞凋亡。这两部分结果说明油酸引起的细胞凋亡至少部分是通过ERS途径来完成的。3HK-2细胞在油酸干预下无论在形态还是功能上均表现出肌纤维母细胞的特性，说明OA干预导致HK-2细胞发生转分化。综合上述，本实验证实油酸既可以诱导细胞凋亡，又可以使其发生转分化，说明油酸在肾小管间质纤维化发生发展过程中起着十分重要的作用。