论文部分内容阅读
副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)引起的以纤维素性浆膜炎、多发性关节炎、胸膜炎和脑膜炎为特征的一种细菌性传染病,给全球养猪业造成了巨大经济损失。HPS感染猪后会引起全身性炎症和败血症,但其致病机理并不是很清楚。NOD1/2受体在识别病原微生物中发挥着重要的作用。NOD1/2通过接头分子RIP2,激活下游的NF-κB和/或MAPKs信号通路,调控炎症反应的发生。本课题组之前的研究已证明HPS感染PK-15细胞可以激活TLRs介导的NF-κB和MAPKs(P38/JNK)信号通路并调控炎症因子的分泌。在本研究中,我们进一步探讨胞质内的模式识别受体NOD1/2在HPS感染PK-15细胞引起炎症反应中的作用,并探索NOD1/2-RIP2信号通路与NF-κB和MAPKs的激活及其下游炎症因子的关系。具体内容如下:1.HPS感染PK-15细胞上调NOD2蛋白表达和RIP2磷酸化水平通过Western Blot方法检测HPS感染PK-15细胞后NOD1和NOD2的变化,结果发现,HPS感染PK-15细胞后能够显著上调NOD2的表达,并呈感染时间和剂量依赖性,而NOD1并不随着HPS感染时间和剂量的提高而变化,提示HPS感染PK-15细胞后可能通过NOD2诱导天然免疫反应。随后,我们进一步分析HPS感染后NOD1/2的下游信号分子RIP2的表达和磷酸化水平的变化,发现HPS感染能诱导RIP2的磷酸化,表明HPS感染PK-15后能够激活NOD1/2-RIP2信号通路。2.NOD1/2-RIP2参与HPS感染PK-15细胞激活NF-κB而不参与激活MAPKs信号通路分别用合成的干扰分子Si-NOD1、Si-NOD2、和Si-RIP2转染PK-15细胞,利用NF-κB荧光素酶报告系统检测HPS感染PK-15细胞中NF-κB的启动子活性,结果发现,转染Si-NOD1、Si-NOD2、和Si-RIP2均能显著下调NF-κB的启动子活性;为了进一步研究NF-κB与NOD1/2-RIP2的相关性,我们又通过Western Blot检测P65的磷酸化水平,结果发现,转染Si-NOD1、Si-NOD2、和Si-RIP2均能显著下调P65的磷酸化蛋白的表达;然而,Si-NOD1、Si-NOD2、和Si-RIP2却不影响P38、JNK和ERK蛋白的磷酸化水平,提示HPS感染PK-15细胞能够通过NOD1/2-RIP2激活NF-κB,但NOD1/2-RIP2不参与激活MAPKs信号通路。3.NOD1/2-RIP2参与HPS感染PK-15细胞产生CCL4、CCL5和IL-8分别用合成的干扰分子Si-NOD1、Si-NOD2、和Si-RIP2转染PK-15细胞,通过Real-time PCR检测CCL4、CCL5和IL-8 m RNA的表达。结果显示,转染Si-NOD1、Si-NOD2、和Si-RIP2均能显著下调CCL4、CCL5和IL-8 m RNA的表达,提示NOD1/2-RIP2参与了HPS感染PK-15细胞产生CCL4、CCL5和IL-8的过程。综上所述,本文证实了NOD1/2-RIP2通过激活下游的NF-κB信号通路参与到HPS感染PK-15细胞引起CCL4,CCL5和IL-8表达的过程,从细胞学角度解释了HPS感染能导致大量炎性因子分泌并引起感染动物发病甚至死亡的分子致病机制。