背景:鼻咽癌是一种起源于鼻咽上皮的恶性肿瘤。研究表明鼻咽癌基因突变罕见,但存在明显的表观遗传学修饰改变。其中,组蛋白甲基化修饰在鼻咽癌的发生发展中发挥着重要作用,特别是组蛋白H3K9的甲基化修饰在鼻咽癌患者中出现了明显的异常。H3K9作为转录调控的活化位点,若甲基化修饰,将抑制其活化作用,使该位点上的基因转录受到抑制。大量的研究报道,该位点上具有众多的原癌基因,此位点的甲基化去除,会使大量原癌基因转录得到增强,从而使细胞的增殖增强、细胞周期加快、迁移和侵袭能力提升,进而产生促癌的表型改变。而对组蛋白H3K9甲基化修饰调控的因子主要包括三种:阅读者,擦除者和书写者。其中H3K9的擦除者主要包括KDM2B,KDM3B,KDM4C和PHD finger protein 8（PHF8）。PHF8是一种经典的组蛋白去甲基化酶,其底物为H3K9me3和H4K20me3。PHF8在多种肿瘤中都存在不同程度的异常表达,其中包括白血病、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、脑胶质瘤、宫颈癌、结肠癌、喉癌、肺癌和食管癌。但PHF8在鼻咽癌发生发展中的具体作用和分子机制不清。目的:我们前期研究发现PHF8在鼻咽癌中存在表达异常,为进一步揭示PHF8在鼻咽癌中的作用与机制,我们拟以三个方面进行研究:（1）PHF8在人鼻咽癌细胞和鼻咽癌组织中的表达情况;（2）PHF8促进人鼻咽癌细胞的生长和侵袭生物学功能研究;（3）PHF8促进人鼻咽癌细胞生长和侵袭的分子机制研究。以明确PHF8去甲基化酶在鼻咽癌细胞的促癌作用和参与鼻咽癌细胞生长和侵袭中的具体机制,为鼻咽癌治疗新靶点提供新的理论基础和实验依据。方法:基于多种生物大数据库分析PHF8在DNA突变、m RNA和蛋白水平的异常;利用RT-PCR检测PHF8 m RNA水平在永生化鼻咽上皮细胞系和鼻咽癌细胞系中的差异表达情况;运用IHC检测PHF8蛋白水平在鼻咽癌组织和非癌性鼻咽上皮组织中的差异表达情况。建立PHF8低表达的HONE1和HK1细胞系,分别采用MTT实验、Ed U实验、平板克隆实验、划痕实验、Transwell迁移侵袭实验、流式凋亡实验、流式周期实验、RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光等分子生物学技术分析PHF8在人鼻咽癌发生发展中的生物学功能,生物信息学分析PHF8在鼻咽癌中的可能分子机制,运用Western blot、RTPCR和双荧光素酶报告基因等技术对生物信息学分析结果加以验证;利用异种移植瘤技术分析PHF8对人鼻咽癌在体内生长的作用,运用免疫组织化学染色进一步验证PHF8在体内对下游基因表达的调控作用。结果:（1）生物信息学提示,PHF8在头颈鳞癌数据集中DNA突变改变和m RNA水平差异不大（P＞0.05）;与其他肿瘤相比,PHF8在鼻咽癌数据集中有较高的表达水平。（2）RT-PCR提示PHF8 m RNA水平在鼻咽癌细胞系中存在高表达,而在永生化鼻咽上皮细胞中表达水平相对较低（P＜0.05）。（3）IHC染色提示,相较于非癌性鼻咽上皮组织和癌旁组织,PHF8蛋白水平在鼻咽癌组织中的表达明显升高（P＜0.05）。其中PHF8在77.3%的鼻咽癌样本中为高表达,与非癌性鼻咽上皮样本（23.5%）阳性率相比,其表达具有显著的差异（P＜0.001）。在分析PHF8表达与临床病理参数相关性时,我们发现PHF8的表达水平与淋巴结转移存在明显的相关性（P=0.0044）,但是其表达水平与年龄（P=0.2553）、性别（P=0.4742）、临床分期（P=0.8177）、分化水平（P=0.2576）和远处转移（P=0.2419）无明显相关性。（4）通过Western blot证实成功构建PHF8低表达的HONE1和HK1细胞系。MTT实验发现,sh-PHF8#5组和sh-PHF8#6组相较于正常组和Vector组其细胞增殖显著降低（P＜0.05）;平板克隆形成实验提示敲低PHF8也可显著抑制鼻咽癌细胞系HONE1和HK1的克隆形成能力;Ed U实验提示,当抑制PHF8的表达水平时,鼻咽癌细XII胞的DNA复制能力亦显著降低（P＜0.05）;Western blot分析发现增殖标记物PCNA和Ki-67的表达水平亦随着PHF8的表达降低而降低;免疫荧光提示,PHF8敲低可抑制PCNA和Ki-67的表达,但其细胞定位不受PHF8的影响;TCGA数据库分析发现,PHF8与Ki-67和PCNA存在明显的正相关关系（P＜0.05）。（5）流式细胞周期实验提示,敲低PHF8可显著诱导鼻咽癌细胞系停滞于G1期（P＜0.05）;Western blot分析发现细胞周期标记物Cdc25A和CCNE1的表达水平亦随着PHF8的表达降低而降低;免疫荧光提示,PHF8可上调Cdc25A和CCNE1的表达,但其细胞定位不受PHF8的影响;TCGA数据库分析发现,PHF8与Cdc25A和CCNE1存在明显的正相关关系（P＜0.05）。这说明PHF8敲低可诱发鼻咽癌细胞周期阻滞。（6）流式细胞凋亡实验提示,当在鼻咽癌细胞系中敲低PHF8后,其凋亡水平显著增高;Western blot分析发现凋亡标记物Bax的表达水平随着PHF8的表达降低而升高,抗凋亡标记物Bcl-2的表达水平随着PHF8的表达降低而降低;免疫荧光提示,Bax表达随着PHF8的表达降低而升高,Bcl-2的表达随着PHF8的表达降低而降低;TCGA数据库分析发现,PHF8与Bcl-2存在明显的正相关关系（P＜0.05）而与Bax存在明显的负相关关系（P＜0.05）。这些结果提示敲低PHF8可促进鼻咽癌细胞的凋亡。（7）划痕实验发现,敲低PHF8可显著抑制鼻咽癌细胞的迁移能力（P＜0.05）;Transwell迁移侵袭实验发现敲低PHF8可显著抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.05）。Western blot分析发现EMT标记物N-cadherin和Vimentin的表达水平亦随着PHF8的表达降低而降低;免疫荧光提示,N-cadherin和Vimentin的表达会受到PHF8的正向调控,但其细胞定位不受PHF8的影响;TCGA数据库分析发现,PHF8与N-cadherin和Vimentin之间没有存在明显的相关关系（P＞0.05）。这些结果提示,PHF8可促进鼻咽癌细胞的EMT以及迁移和侵袭。（8）随后我们构建了PHF8高表达质粒,将其转染至永生化鼻咽上皮细胞NP69中,通过Western blot证实构建高表达PHF8的NP69细胞成功。MTT实验提示,过表达PHF8可显著提高NP69细胞的增殖能力（P＜0.05）;Ed U实验发现,PHF8具有显著促进NP69细胞DNA复制的能力（P＜0.05）;Western blot提示PHF8可上调增殖标记物Ki-67和PCNA的表达水平（P＜0.05）,提示过表达PHF8可促进NP69细胞的增殖。（9）流式细胞周期实验提示,过表达PHF8可减少NP69细胞的G1期细胞阻滞;Western blot提示PHF8可上调周期标记物Cdc25A和CCNE1的表达（P＜0.05）。这提示PHF8可加速NP69的细胞周期。XIV（10）划痕实验和Transwell迁移侵袭实验均发现过表达PHF8可促进NP69细胞系的迁移和侵袭能力（P＜0.05）;Western blot提示PHF8可上调侵袭标志物N-cadherin和Vimentin的表达水平。这提示PHF8可增强NP69的迁移侵袭能力。（11）基于TCGA数据库中的头颈鳞癌数据集,提取与PHF8相关基因,通过R语言进行火山图和热图的可视化。将该组差异基因通过PCA主成分分析发现,该组基因能显著区分头颈鳞癌样本及头颈鳞癌癌旁样本。进一步将该组基因导入String数据库,构筑PPI蛋白与蛋白互作网络,通过Cytoscape软件进行拓扑优化,筛选关键基因。将关键基因导入DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析,对PHF8所引起的可能分子生物学作用进行预测,结果提示PHF8可能直接参与转录调控、DNA结合、组蛋白结合和细胞周期调控等功能调控的机制。进一步通过GSEA富集分析发现,PHF8可能参与细胞紧密连接等功能的调节。蛋白结构分析发现PHF8具有Jmj C结构域（调控组蛋白去甲基化）和锌指结构域（转录因子特征,参与DNA启动子区域的靶向螯合）,提示PHF8可能通过结合至靶基因的启动子区域,调节组蛋白甲基化水平,进而改变染色质的松紧程度,从而对靶基因进行转录调控。（12）通过GEO数据库,利用结合位点分析法（Ch IP-sequence）分析发现PHF8与Vimentin、Cdc25A和DVL2的启动子区域有显著的Peak峰;RT-PCR提示,敲低PHF8可显著降低Vimentin、Cdc25A和DVL2的转录水平;双荧光素酶报告基因提示,PHF8可显著结合于Vimentin、Cdc25A和DVL2的启动子区域;Western blot提示,敲低PHF8可显著增加H3K9me1和H4K20me1的水平。这些结果提示PHF8可能通过去除Vimentin、Cdc25A和DVL2启动子区域的组蛋白甲基化水平,降低启动子区域染色质的压缩程度,促进Vimentin、Cdc25A和DVL2转录。（13）通过Western blot发现,敲低PHF8抑制DVL2的蛋白表达,以及β-catenin的核转位,双荧光素酶报告基因TOPFlash实验检测Wnt/β-catenin的活化程度。RT-PCR分析Wnt/β-catenin通路下游基因的转录情况。提示PHF8可通过转录调控上调DVL2的表达,促进β-catenin的核转位进而活化Wnt/β-catenin信号通路,加速鼻咽癌的发生发展。（14）通过异种移植瘤模型发现,敲低PHF8可抑制鼻咽癌细胞的生长。免疫组织化学染色发现敲低PHF8可抑制Ki-67,PCNA,Cdc25A,CCNE1,BCL-2,N-cadherin,Vimentin和DVL2的蛋白水平;增强BAX,H3K9me1和H4K20me1的蛋白水平;抑制β-catenin的核转位现象。体内实验结果提示PHF8可通过上调DVL2的表达,促进β-catenin的核转位进而活化Wnt/β-catenin信号通路,并调控增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭等蛋白表达水平促进鼻咽癌在体内的生长。结论:1.鼻咽癌组织样本中的PHF8蛋白表达水平相较于非癌性鼻咽上皮显著升高。2.PHF8可促进鼻咽癌细胞增殖;加速细胞周期;促进细胞迁移和侵袭;抑制细胞凋亡。3.组蛋白去甲基化酶PHF8可能通过降低Vimentin、Cdc25A和DVL2启动子区域组蛋白甲基化位点H3K9me1和H4K20me1的水平,促进Vimentin、Cdc25A和DVL2转录活化,并激活Wnt/β-catenin通路。