论文部分内容阅读
目的： 研究偶联CD133多肽的酞菁缀合物光敏剂（CD133polypeptide-phthalocyanine conjugate,CD133-Pc）的光动力治疗（Photodynamic therapy，PDT）对人结肠癌干细胞（Colorectalcancer stem cells,CRC-CSCs）体外生物学特性的影响，并探讨相关分子机制。 方法： 1、CRC-CSCs分离、富集和鉴定。用磁珠分选技术分离出CD133+的结肠癌细胞；用结肠癌干细胞条件培养基悬浮培养，富集和扩增CRC-CSCs；用流式细胞仪检测其表面标志物CD133的表达；用体外极限稀释法验证CRC-CSCs的自我更新能力；用蛋白质免疫印迹检测干性相关蛋白表达；用裸鼠皮下移植瘤模型验证CRC-CSCs的致瘤性。 2、观察CD133-Pc细胞内吞和亚细胞定位。将CD133-Pc或Pc孵育结肠癌亲本细胞或CRC-CSCs，用荧光探针定位细胞器，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察CD133-Pc和Pc的细胞内吞和亚细胞定位。 3、体外光动力治疗研究。用不同浓度CD133-Pc或传统光敏剂处理永生化结肠上皮细胞、结肠癌亲本细胞或CRC-CSCs后进行激光照射，用Alamar Blue法测定细胞生存活力；用悬浮培养法测定结肠癌细胞的肿瘤球形成能力和CRC-CSCs的自我更新能力；蛋白质免疫印迹检测相关机制的蛋白水平变化；2,7"-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）孵育后用流式细胞仪检测ROS水平；用流式细胞仪（Annexin V/PI染色）检测细胞凋亡；通过ROS抑制剂和自噬抑制剂验证ROS和自噬在光动力治疗中的作用。 4、过表达Notch1。用携带嘌呤霉素抗性和过表达Notch1基因的慢病毒载体感染CRC-CSCs，用嘌呤霉素筛选构建过表达Notch1的CRC-CSCs稳定细胞系。 结果： 1、经磁珠分选和无血清超低粘附悬浮培养从人结肠癌亲本细胞HT29和SW620中分离和富集CRC-CSCs；流式细胞术检测CD133表达，分选后HT29和SW620的CD133阳性率分别为86.1%和98.6%；经磁珠分选和超低粘附悬浮培养后，HT29和SW620的CD133、c-Myc、Nanog、Oct-4蛋白水平增加；裸鼠移植瘤实验证实CRC-CSCs较亲本细胞具有高两个数量级的致瘤性。 2、CRC-CSCs比结肠癌亲本细胞内吞CD133-Pc效率高；在结肠癌亲本细胞中，高表达CD133的细胞內吞CD133-Pc效率高；在CRC-CSCs中，内吞CD133-Pc效率高于Pc；CD133-Pc聚集在线粒体、溶酶体和内质网中。 3、随CD133-Pc的浓度升高，PDT降低结肠上皮细胞、结肠癌亲本细胞和CRC-CSCs的生存活力，但是CD133-Pc PDT对结肠癌细胞的杀伤作用大于永生化结肠上皮细胞；CD133-Pc的杀伤作用强于传统光敏剂Photosan和未偶联CD133的Pc；CD133-Pc PDT对CRC-CSCs的杀伤作用随激光强度增强而增强；在体外，CD133-Pc PDT1小时细胞即发生形态改变。 4、CD133-Pc PDT抑制结肠癌亲本细胞的肿瘤球形成和CRC-CSCs的自我更新能力；CD133-Pc PDT降低CRC-CSCs中的Notch1和Nanog蛋白水平；过表达Notch1的CRC-CSCs抵抗CD133-Pc PDT。 5、经不同浓度CD133-Pc对CRC-CSCs进行光动力处理，流式细胞仪检测结果显示细胞内ROS水平随CD133-Pc浓度增加而增高；同时Nrf2和Keap1蛋白水平随CD133-Pc浓度增高而增高；添加ROS抑制剂后能够逆转CD133-Pc PDT对CRC-CSCs的生存活力的抑制作用。 6、经不同浓度CD133-Pc对CRC-CSCs进行光动力处理，流式细胞仪检测结果显示细胞的凋亡比例随CD133-Pc浓度增加而增高。 7、经不同浓度CD133-Pc对CRC-CSCs进行光动力处理，免疫荧光结果显示随CD133-Pc浓度增加，LC3表达逐渐增多；蛋白质免疫印迹结果显示CD133-Pc PDT促进CRC-CSCs的自噬；添加自噬抑制剂后能够逆转CD133-Pc PDT对CRC-CSCs的生存活力的抑制作用。 结论： 1.通过磁珠分选CD133+细胞和悬浮培养法分离和富集的CRC-CSCs具有结肠癌干细胞特性。 2.CD133-Pc PDT在体外能够有效杀伤CRC-CSCs。 3.CD133-Pc PDT的杀伤作用的机制是细胞通过内吞CD133-Pc后，经激光照射产生ROS，抑制Notch信号通路，进而抑制结肠癌干细胞的干性特征和诱导细胞程序性死亡。