肺癌是在世界范围内,男、女性人群中致死率最高的癌症,近年来肺癌的发病率也是增长最快,是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌从组织学类型上可以分为两大类:小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer NSCLC),其中,85%左右的患者属于非小细胞肺癌。与小细胞肺癌相比,非小细胞肺癌的癌细胞生长分裂速度较慢,出现扩散和转移相对较晚,但是,大约75%的患者发现时已处于中晚期,导致治疗效果差,5年生存率很低。尽管近20年以来,在体检仪器的先进、外科手术技术的提高、放化疗方案的改进以及基因靶向治疗等方面,都取得了很大的进步,但是非小细胞肺癌的总体治疗效果仍然不佳。以顺铂(Cisplatin,DDP)为基础的化疗方案仍是目前肺癌化疗最有效的方案,但是大部分患者出现的顺铂耐药(Cisplatin-Resistance)使治疗效果明显降低,因而寻找解决顺铂耐药的方法,具有重要的科学意义与临床价值。顺铂耐药的形成,是多种机制导致的结果,目前公认的主要包括三方面:(1)基因突变和线粒体的凋亡;(2)基因修复增强;(3)细胞的凋亡受阻。另外,药物传递系统、代谢水平以及肿瘤微环境的变化如缺氧等因素,也会造成NSCLC的顺铂耐药。国内外大量学者长期致力于从基因层面来逆转NSCLC顺铂耐药的研究,发现了很多与NSCLC顺铂耐药有关的基因及信号通路,例如FHIT、PI3K-NFκB信号通路等;并且利用基因沉默或过表达技术,增强NSCLC的顺铂敏感性,取得了肯定的效果。基于此,我们课题组也从事了相关的研究,发现了白介素6(IL-6)及其下游信号通路与NSCLC顺铂耐药存在一定的关系:第一部分IL-6及其信号通路通过上调非小细胞肺癌DNA修复相关分子表达增强和抗凋亡能力诱导其产生顺铂耐受目的:明确IL-6在非小细胞肺癌顺铂耐药发生发展过程中的作用及其可能机制。方法:我们利用慢病毒载体携载IL-6 si RNA以及对照sc si RNA联合高效转染试剂盒转染A549、H157非小细胞肺癌细胞株;通过Q-PCR技术检测转染细胞中IL-6m RNA表达量水平;利用顺铂分别干预不同组细胞,通过MTT技术检测顺铂对不同组细胞的细胞毒性;利用流式细胞术检测顺铂作用后不同组细胞的凋亡水平;并且通过Q-PCR、Western-blot技术检测顺铂作用前后不同组细胞内DNA修复相关基因ATM、CHK1等以及凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1等基因的表达水平;为了探究IL-6在顺铂耐药过程中可能参与的信号通路,我们利用不同信号通路抑制剂干预,然后通过Q-PCR、Western-blot技术检测相关基因及蛋白的表达量;建立不同细胞的皮下移植瘤裸鼠模型,监测并记录顺铂干预前后皮下移植瘤的生长速度、肿瘤大小、裸鼠体重等变化情况,最后处死裸鼠,获取肿瘤组织,行HE染色以及免疫组化染色,检测不同处理组肿瘤中上述相关基因以及蛋白的表达水平。结果:利用慢病毒介导的方法,我们获得了IL-6敲除细胞(A549 IL-6si和H157IL-6si)及其相应的加扰对照细胞系(A549sc和H157sc)。Q-PCR和IL-6 Elisa分析均证实IL-6si细胞株具有较高的敲除效率(90%以上)。当用MTT法检测顺铂对这些细胞的细胞毒性时,发现IL-6敲除的A549和H157细胞比其加扰的对照细胞更敏感;在动物实验研究中,我们发现,在顺铂治疗后A549 IL-6si细胞来源的异种移植瘤生长明显低于的A549sc细胞。这些结果表明IL-6的敲除使肿瘤细胞对顺铂更敏感,并且与体外细胞毒性结果一致;我们进一步分析了肿瘤组织中多种分子的表达,以确定IL-6与顺铂敏感性的关系。免疫组化染色证实了细胞源性肿瘤中IL-6的敲除状态。当用增殖标记物ki67的抗体行免疫组化染色时,在A549 IL-6si细胞源性肿瘤中检测到少量ki67阳性细胞,这与肿瘤生长数据一致。利用Annexinv流式细胞术分析细胞的凋亡情况,结果表明:IL-6si细胞组凋亡率高于sc细胞(A549细胞凋亡率分别为8.7%和2.8%,H157细胞凋亡率分别为9.5%和3.9%)。当在IL-6si/sc细胞对中检测促凋亡(Bax)和抗凋亡(Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1)分子的m RNA和蛋白质的表达时,Q-PCR及Western-blot实验数据证实顺铂处理的Sc细胞中Bcl-2和Mcl-1的表达(而不是Bcl-xl和Bax)显著增加,而在si细胞中未出现此结果;并且肿瘤组织的IHC染色支持了体外实验的结果,显示来自Sc细胞的肿瘤中Bcl-2和Mcl-1染色细胞的数量高于IL-6 si细胞来源的肿瘤。在作用机制研究方面,我们发现:顺铂处理后,ATM和CHK-1的表达水平在表达IL-6的A549sc和H157sc细胞中显著上调,但在A549IL-6si和H157IL-6si细胞中没有上调。此外,本实验还研究了可诱导细胞凋亡的p53和p73的表达水平,以及DNA切除修复蛋白ERCC1。与ATM和CHK-1的结果相似,在顺铂处理后,所有这些分子在表达IL-6的A549sc和H157sc细胞中的表达都显著上调,但在A549IL-6si和H157IL-6si细胞中没有上调。同时,从肿瘤组织获得的IHC染色数据也显示A549sc异种移植瘤中ATM和CHK-1染色细胞的数量高于A549IL-6si移植瘤;在信号通路研究中,我们发现,STAT3、ERK、MAPK和AKT信号通路,无论是否接受顺铂治疗,我们发现它们都在表达IL-6的A549SC和H157SC细胞中高度激活,但在IL-6敲除的A549 IL-6Si和H157 IL-6Si细胞中没有显著升高;在表达IL-6的A549SC和H157SC细胞中分别加入抑制MAPK、AKT、JAK/STAT3和MEK/ERK各个信号通路的抑制剂(分别为SB203850、LY294002、AG490和U0126),然后检测顺铂是否能阻断Bcl-2和ERCC1两种分子的上调。结果提示添加MAPK、AKT和MEK/ERK途径的抑制剂几乎完全阻断了Bcl-2和ERCC1分子的上调,而使用JAK/STAT3途径抑制剂的组则观察到较小的影响。结论:NSCLC细胞对顺铂的敏感性取决于细胞内IL-6的水平,高表达IL-6的NSCLC细胞更容易发生顺铂耐药,比细胞内IL-6水平较低或无IL-6的细胞存活的机会更高。在顺铂治疗后,高表达的IL-6通过上调了抑制凋亡(Bcl-2,Mcl-1)和DNA修复相关分子(ATM,CHK-1,ERCC1,P53,TP73)的表达,并且IL-6上调与抑制凋亡和DNA修复过程相关的基因是通过激活信号通路,MEK/ERK信号通路、P38MAPK、EGFR-STAT3信号通路和AKT信号转导参与了DNA修复过程的调控。既然已经明确了基因IL-6与NSCLC顺铂耐药之间的关系,因此有理由相信若能有效降低NSCLC患者IL-6的表达,定能增强对顺铂的敏感性,从而延缓或逆转顺铂耐药。可是基础研究中使用的病毒载体由于其免疫原性以及缺乏特异性,限制了其进一步的应用。基因治疗最重要的就是基因载体的开发研究,近年来,研究人员已开发了多种传递基因的材料,包括病毒载体和非病毒载体。病毒基因载体具有较高的转染效率,但其特异性和免疫原性的缺乏限制了其进一步的应用。非病毒基因载体由于其合成简单、免疫原性低、转染效率高,在临床转化中具有广阔的应用前景。支化聚β-氨基酯是一种新型的非病毒载体,具有强大的基因运载功能。然而,由于高分子量和高密度正电荷带来的细胞毒性的增加影响了其应用。因此,很多研究者思考,能否将高包载能力、高分子量的纳米载体在完成基因递送后通过外界刺激,使纳米材料降解、加速从体内排出,以此来降低材料的毒性。鉴于此,近年来,越来越多的新型响应型纳米材料载体问世,比如光敏感、热敏感、p H响应、ROS响应等等,在基础研究中取得了显著的效果,为进一步投入临床使用奠定了坚实的理论基础。基于临床与基础研究的紧密结合,我们与苏州大学纳米学院殷黎晨教授团队设计了刺激响应型聚合物基因递送系统,开展了初步的研究:第二部分紫外光响应、可快速降解的枝化聚β-氨基酯用于基因递送的研究目的:设计合成性质稳定的、紫外光(UV)响应的超支化聚β-氨基酯(branched poly(β-amino ester),BPAE-NB)用于基因的靶向递送,验证其高效性、可控性以及安全性。方法:我们通过A2(胺)+B3(三丙烯酸酯)+C2(二丙烯酸酯)迈克尔加成反应合成了支链型BPAE-NB,其中支链单体(B3)被用于形成高度支链结构,含硝基苯单体(NPBMDA,A2)被选择为紫外光敏感基团赋予聚合物紫外响应的可降解性。进一步用1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪(mpz)将所得到的聚合物予以封端以提高阳离子电荷密度,从而得到紫外响应的支化聚β-氨基酯(BPAE-NB),并且同法合成了紫外光不敏感的BPAE-CC用于实验对照,两者的基因携载效果与直链的聚β-氨基酯(LPAE-NB)做对比,并且通过400MR核磁共振氢谱(~1H NMR)分别对三种不同材料做表征。将三种不同的材料与DNA、si RNA复合,检测不同复合物的紫外光照射后聚合物粒径大小、电势变化;使用凝胶渗透色谱法(GPC)、动态光散射(DLS)、琼脂糖凝胶电泳实验、肝素钠置换实验等对各聚合物进行检测表征。通过流式细胞术和荧光显微镜分析不同聚合物携载荧光EGFP的细胞内转染情况;并且通过共聚焦扫描显微镜(CLSM)技术检测不同聚合物进入细胞后动力学情况。通过MTT实验检测材料本身以及DNA/si RNA与不同材料形成的聚合物对细胞的毒性。结果:我们设计合成了稳定的紫外光(UV)响应的超支化聚β-氨基酯(branched poly(β-amino ester),BPAE-NB),紫外光不敏感的BPAE-CC以及线性聚合物(linear poly(β-amino ester),LPAEs)。聚合物的化学结构通过~1H NMR表征。BPAE-NB的支化度(Degree of Branching,DB)为0.55。用凝胶渗透色谱法(GPC)测定BPAE-NB的Mw,其Mn为18.1 k Da,PDI为1.83,较LPAE分子量更大,螺旋度更高。我们利用紫外可见光谱和凝胶渗透色谱研究了光引发的聚合物降解。当BPAE-NB的DMF溶液在紫外光(λ=365 nm,20 mw/cm~2)下照射2 min时,观察到280 nm(OD280)处的吸光度显著增加。GPC分析进一步证实了BPAE-NB的降解作用。BPAE-NB的MWs在紫外线照射下(λ=365 nm,20 mw/cm~2,10 min)显著降低,色谱峰几乎消失。相比之下,紫外光不能降解不敏感的BPAE-CC,因此其分子量保持不变,色谱峰无明显变化。通过凝胶阻滞试验验证BPAE-NB缩合DNA的能力。结果显示:在1%琼脂糖凝胶中,在聚合物/DNA重量比高于0.5的情况下,DNA迁移完全被阻止,这表明DNA与分枝结构的BPAE-NB完全缩合。相比之下,线性LPAE-NB表现出较弱的DNA缩合能力,它要求更高的聚合物/DNA重量比,在15:1条件才能完全缩合DNA。定量EB拍阻试验进一步验证了这些结果,其中85%以上的DNA通过BPAEs在聚合物/DNA重量比大于1时缩合,而LPAE-NB在聚合物/DNA重量比大于10时才能达到85%的DNA浓缩效率。DLS的测量结果也一致表明,在BPAE/DNA重量比≥5时,形成了直径约180 nm、表面正电荷约30 mv的复合物。以p Luc为示踪质粒,我们在Hela细胞中检测了多种复合物各自的转染效率。在最佳重量比为15:1时,BPAE-NB/DNA或BPAE-CC/DNA复合物的转染效率显著高于LPAE-NB/DNA复合物,与阳性对照的PEI相比较而言,BPAE-NB的转染效率提高了15倍,并且显示紫外光照射显著促进了BPAE-NB/DNA复合物的转染效率,但没有促进BPAE-CC/DNA复合物的转染效率。我们研究了不同聚合物和Yo Yo-1-DNA形成的复合物的细胞摄取水平和内化机制。结果表明BPAE-NB以10～30的聚合物/DNA重量比条件下明显地促进Hela细胞内DNA的摄取,比LPAE-NB和PEI增强2～4倍。非紫外光光敏感BPAE-CC由于其相似的阳离子电荷密度和分子结构,表现出与BPAE-NB相似的DNA摄取水平,明显高于LPAE组。同样的,CLSM也显示出BPAE-NB/DNA复合物的细胞摄取水平高于LPAE-NB/DNA复合物。在细胞摄取机制研究方面,摄取实验结果表明:4℃时细胞摄取明显减少70%以上,CPZ、GNT和mβCD对细胞摄取水平也有明显的抑制作用,而WTM对细胞摄取水平无明显的抑制作用。MTT检测细胞毒性实验结果表明:在有效转染的浓度下,材料本身的细胞毒性不大,并且紫外光照射显著降低了BPAE-NB/DNA复合物的细胞毒性,并且在一定时间范围内具有时间依赖性,而光不敏感的BPAE-CC/DNA复合物的细胞毒性没有降低。并且我们发现,对比DNA,完全包载si RNA需要更多的材料,相较于LPAE包载si RNA需要的比例150:1(LPAE:si RNA,w/w),BPAE凸显出了更加明显的优势15:1(BPAE:si RNA,w/w),克服了使用大剂量材料带来的毒性,我们选用了凋亡抑制基因Survivin作为靶基因,应用BPAE包载Survivin-si RNA成功转染Hela细胞,通过Q-PCR检测survivin m RNA水平明显降低,并且通过MTT法验证survivin knockdown之后细胞活力明显下降。结论:我们设计并开发的具有内置光敏感可降解的枝化度高的BPAE-NB,具有多价结构,具有较强的DNA/si RNA缩合能力,具有较高的跨膜基因传递效率。在紫外光激发下,BPAE-NB可以发生瞬时降解,触发细胞内DNA/si RNA释放,增强基因转染效率,同时在转染后材料自我毒性降低。为解决基于多聚阳离子的基因载体的效率-毒性的矛盾提供了一种有效的途径,为非病毒基因递送材料的合理设计提供了切实可行的办法和新的思路和策略。