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目的 血栓形成导致的疾病严重地影响了人类健康。有大量研究表明,参与血栓形成的很多重要蛋白的生物活性依靠变构二硫键来调节。蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族是内质网中含有硫氧还蛋白结构域的一组蛋白酶,其主要功能是调控底物蛋白二硫键的形成、断裂和重排。近期有研究表明多种PDI家族成员在血栓形成中发挥重要作用,其中PDI、ERp57和ERp72促进血栓形成,TMX1抑制血栓形成。基于他们的正向或负向调控作用,我们推测PDI家族的不同成员协同发挥作用,构成调控血栓形成的氧化还原网络,这可能是血栓形成的新机制。因此,为了更深入和全面地认识这一调控网络,我们进一步筛查了 PDI家族中其它成员是否也参与血栓形成调控。我们的预实验结果提示,thioredoxin related transmembrane protein 3(TMX3)可能在血栓形成中发挥重要作用。TMX3是一种I型跨膜蛋白,具有氧化酶和还原酶活性,在血小板和内皮细胞表达,并随血小板活化而在细胞表面增加表达。本课题旨在确定TMX3在血栓形成中的作用,并认识其作用的分子机制。实验方法 我们构建了造血系及内皮细胞TMX3特异性敲除(Tie2-cre/TMX3fl/fl)小鼠以及血小板TMX3特异性敲除(Pf4-cre/TMX3fl/fl)小鼠,通过鼠尾出血模型和激光损伤提睾肌动脉血栓形成模型,判定TMX3在止血过程与血栓形成中的作用。通过血小板聚集、ATP释放、P-selectin表达、JON/A结合、血小板粘附铺展和血块收缩等体外实验,判定TMX3在各种血小板生理功能中的作用。通过检测活化血小板内蛋白磷酸化水平、整合素αⅡbβ3与talin-1蛋白的结合情况、血小板钙离子动员、钙离子载体介导的血小板聚集和ATP释放,判定TMX3在血小板活化中发挥作用的环节和途径。通过使用apyrase去除血小板释放的ADP和给TMX3敲除血小板补偿ADP的策略,做血小板聚集及ATP释放实验,判定TMX3调控血小板聚集的作用是否与介导ADP释放有关。通过使用表面等离子共振技术和蛋白巯基标记与检测技术,明确TMX3与整合素αⅡbβ3之间的亲和力以及TMX3对αⅡbβ3的催化作用。通过检测血小板介导的凝血酶生成实验和血小板表面磷脂酰丝氨酸的表达,判定TMX3在血小板介导的凝血系统活化中的作用。给β3敲除小鼠注射无酶活性TMX3突变蛋白,应用激光损伤提睾肌动脉血栓形成模型,判定内皮细胞TMX3在不依赖于血小板的凝血系统活化中的作用。实验结果 我们成功构建了 Tie2-cre/TMX3fl/fl小鼠和Pf4-cre/TMX3fl/fl小鼠,Tie2-cre/TMX3fl/fl小鼠的血小板和内皮细胞中TMX3 mRNA和蛋白表达缺失,PDI、ERp57、ERp72和TMX1等同家族成员表达无异常;Pf4-cre/TMX3fl/fl小鼠的血小板中TMX3 mRNA和蛋白表达缺失,PDI、ERp57、ERp72和TMX1等同家族成员表达无异常。与同窝野生型小鼠相比,Tie2-cre/TMX3fl/fl小鼠的血细胞数目,主要凝血蛋白表达与活性,以及血小板表面主要膜受体表达等各项指标均无异常,但尾巴出血时间延长,动脉损伤部位血小板积聚和纤维蛋白沉积减少。这些研究结果说明TMX3在止血和血栓形成过程中发挥重要的正调控作用。Pf4-cre/TMX3fl/fl小鼠的尾巴出血时间延长,说明血小板TMX3在止血中发挥重要作用。当使用四种不同受体激动剂(thrombin,convulxin,U46619,ADP)刺激时,与对照血小板相比,Pf4-cre/TMX3fl/fl小鼠血小板的聚集和ATP释放均明显减弱。使用凝血酶刺激后,与对照血小板相比,Pf4-cre/TMX3fl/fl小鼠血小板P-selectin表达和JON/A结合明显减少,但二者血小板铺展和血块收缩没有差异。TMX3的缺陷不影响血小板蛋白磷酸化、β3-talin1结合以及钙离子动员,而抑制钙离子载体导致的ATP释放。这组结果提示TMX3作用于血小板钙离子动员后的颗粒释放,但是不影响血小板整合素αⅡbβ3外向内和内向外信号途径。加入apyrase后,野生型血小板的聚集和TMX3敲除血小板没有差异;加入ADP后,TMX3敲除血小板的聚集补偿到和野生型血小板同样的水平,提示TMX3缺陷血小板聚集的减弱可能是由于ADP释放减少导致。TMX3与整合素αⅡbβ3之间有较强亲和力,且TMX3催化αⅡbβ3二硫键的还原反应。与对照血小板相比,TMX3敲除血小板的促凝活性更弱,phosphatidylserine(PS)表达也更低。在激光损伤β3敲除小鼠提睾肌动脉血栓形成模型中,注射无酶活TMX3蛋白导致血小板积聚,纤维蛋白沉积减少,提示内皮细胞TMX3在凝血系统活化中发挥重要作用。结论 TMX3是第一个被发现正向调控止血和血栓形成的跨膜型二硫键异构酶,它双重促进血小板活化和凝血系统激活,可能是防治血栓性疾病的新靶点。