研究背景和目的结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)及胃癌(Gastriccancer)是世界上常见的消化道恶性肿瘤。在美国等发达国家结直肠癌居癌症发病率第三位,死亡率第二位,其在我国恶性肿瘤中发病率为第四位。目前,结直肠癌的确切病因尚未完全清楚,随着分子生物学技术以及对疾病认识的快速发展,人们普遍认为结直肠癌的发生、发展表现为一个多因素、多阶段、多步骤的协同累积过程,是遗传与环境多种因素共同作用的结果。众所周知癌基因及抑癌基因均参与了肿瘤的发生发展,其中包括癌基因的激活、抑癌基因的缺失或突变失活,除此之外还有错配修复基因(mismatch repair,MMR)的突变及失活。抑癌基因的失活在其中发挥重要作用。各地资料显示随着人民生活水平的提高,饮食结构的改变,其发病率呈逐年上升趋势。胃癌作为全球高发的消化道肿瘤之一,是由多因素综合作用的结果,例如幽门螺杆菌的感染,吸烟及胃溃疡等等,但其确切的发病机制尚未清楚。尽管目前癌症的确切发病机理尚未完全阐明,对肿瘤发病机制的进一步研究使人们已从过去单一的物理致癌、化学致癌、病毒致癌、突变致癌学说上升到多步骤、多因素综合致癌理论。目前,人们已逐渐接受这种观点,即肿瘤的发生是一个渐变的过程,涉及多个癌基因的激活和抑癌基因的失活。长期以来人类对X染色体的认识多限于决定性别,但如今X染色体在肿瘤发生发展中的作用逐渐被认识,越来越多的证据显示X染色体与肿瘤相关,但是确切机制尚不清楚。来自美国麻省总医院癌症中心,Dana-Farber癌症研究院等处的研究人员对肾胚细胞肿瘤(Wilms肿瘤)的DNA拷贝数突变进行高通量筛选,发现了 X染色体上一个新基因的体细胞缺失,研究人员将其命名为WTX,WTX在大约三分之一的Wilms肿瘤中是失活的。Rivera等在2007年《Science》杂志上公布了这一研究成果,由于X染色体定位的特殊性,WTX作为抑癌基因具有独特的作用特点和研究价值,因此这一研究成果首次公布后立即引起了医学科研领域的关注。研究人员还发现WTX在胚肾发育细胞中也表达,说明该基因在器官形成过程中也扮演着重要的角色。肿瘤的发生与发展是多基因及信息协同作用的结果,癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活均可导致细胞正常生理调控信号通路分子不恰当的活化和失活,使细胞增生失控而致肿瘤形成。因此,一些经典的信号通路在肿瘤的发生、发展中起到了重要的作用。Wnt/β-catenin信号通路就是这方面的经典之一;该信号通路是一类传导生长刺激信号的通路,它主要在胚胎发育过程中被激活,参与多种发育模式,在正常成熟的细胞中处于关闭状态。早期Wnt信号转导通路的缺陷可导致多种生物发育缺陷,同时Wnt信号途径的异常激活又与多种肿瘤的发生密切相关。目前已知有十几种的高发性恶性肿瘤源于Wnt信号转导途径的失调,其中β-catenin的异常活化在肿瘤发生中发挥了重要作用。Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育和肿瘤进展中的作用已得到公认。文献报道,WTX可以与AXIN1,β-catenin,APC和β-TrCP2形成复合物导致β-catenin降解从而负性调节Wnt/β-catenin信号通路。WTX基因突变在Wilms瘤中常见,并导致其表达缺失;目前在肿瘤研究方面,对WTX基因的研究主要集中在肿瘤中WTX基因的突变率分析,但WTX基因突变在肾外肿瘤中并不常见;其在其他肿瘤(包括结直肠癌及胃癌)中的表达情况和可能的失活状态的具体机制尚未见报道,有待探明。尚未有研究表明WTX的具体作用机制。在非肿瘤研究方面,还发现WTX在硬化性骨病、抗氧化反应、细胞分化等疾病中发挥作用。基于WTX基因功能和在胃肠肿瘤中的研究现状,本研究将探讨WTX在结直肠癌和胃癌中的作用、意义和可能机制,为揭示胃肠肿瘤发生发展机制提供可能的依据。研究方法1.抑癌基因WTX在结直肠癌中的作用及初步研究1.1 WTX在不同转移潜能结直肠癌细胞系中的表达采用荧光定量 PCR 和 Western blot 检测了 SW480、SW620、HT29、LOVO、HCT116、LS174T6种结直肠癌细胞系中WTX基因的表达。1.2 WTX基因过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响1.2.1通过G418抗性筛选建立WTX稳定过表达结肠癌细胞株(SW620W+)及对照细胞株(SW620N1)并进行鉴定;1.2.2利用CCK比色法、平板克隆形成率和Transwell细胞迁移实验、划痕实验、裸鼠皮下成瘤及原位种植试验检测WTX基因过表达对SW620细胞增殖、侵袭能力的影响。1.3结直肠癌中WTX基因作用分子机制的初步研究利用Western blot检测SW620W+及对照细胞SW620N1中EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、β-catenin 蛋白水平的表达。2.抑癌基因WTX在胃癌中的作用及机制初步研究2.1免疫组化检测及Western blot检测胃癌及其配对正常组织中WTX蛋白的表达2.2 WTX基因在不同转移潜能胃癌细胞系和胃癌及配对正常胃组织中的表达分析。采用荧光定量PCR的方法检测了 MGC803、MGC823、BGC823 3种胃癌细胞和43对胃癌组织及其配对正常组织中WTX基因的表达。3.统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。2-△△Ct值分析荧光定量PCR结果、Transwell迁移实验、平板克隆形成实验均采用两独立样本t检验(Independent-Samples T test)。CCK8体外增殖及裸鼠皮下成瘤实验采用析因设计(Factorial design analysis of variance)的方差分析和单因素方差分析(One-Way ANOVA)。免疫组化采用Mann-Whitney U Test,相关性分析采用Spearman等级相关性检验。P<0.05为差异有统计学意义。研究方法和结果:1.抑癌基因WTX在结直肠癌中的作用及机制研究1.1 WTX基因在不同转移潜能结直肠癌细胞系中的表达荧光定量PCR结果显示,6种结直肠癌细胞系之间WTX mRNA的表达不一致,差异有统计学意义(F=10.146,P<0.05)。以SW620细胞为参照,WTX在SW480,LOVO 中表达量高于 SW620(P<0.001,P<0.01),而 HT29、LS174T、HCT116 和 SW620 之间无明显差异(P=0.462,P=0.188,P=0.214).Western blot 结果显示,WTX蛋白在除SW480细胞外,均呈低表达状态,在SW480细胞中蛋白表达量明显高于SW620细胞。1.2 WTX基因稳定过表达细胞株的构建及鉴定1.2.1利用G418抗性筛选分别构建WTX基因稳定过表达及其对照载体的结直肠癌细胞株SW620W+和SW620N1;1.2.2荧光定量PCR鉴定SW620W+和SW620N1之间WTX的表达差异。结果显示两种细胞系之间WTX表达差别明显,有统计学意义(t=13.695,P<0.05);Western blot检测证实SW620W+细胞组WTX基因的表达量较SW620N1明显升高,说明SW620W+和SW620N1均构建成功。1.3 WTX基因稳定过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响1.3.1 CCK8细胞增殖实验SW620N1/SW620W+两组细胞间的生长时间水平差异具有统计学意义(F=1167.865,P<0.001);并且细胞组间增殖能力差异具有统计学意义(F=11.721,P<0.001);同时细胞时间与组间交互效应差异也有统计学意义(F=3.280,P<0.001)。以上结果说明,过表达WTX可明显抑制SW620细胞体外增殖。1.3.2平板克隆形成实验SW620N1组和SW620W+组的克隆形成率分别为53.333%、16.222%,过表达WTX基因后细胞克隆形成率明显减弱,差异具有显著性(t=18.442,P<0.001)。1.3.3 Transwell小室侵袭实验SW620W+组较SW620N1组细胞侵袭能力明显减弱,差异具有显著性(t=12.181,P<0.001)。1.3.4 Transwell小室迁移实验SW620W+组较SW620N1组细胞迁移能力明显减弱,差异具有显著性(t=27.081、p<0.001)。1.3.5划痕实验检测细胞迁移能力SW620N1组划痕后72h细胞间距明显窄于SW620W+组。结果表明,与SW620N1组相比,SW620W+组结直肠癌细胞迁移能力降低。1.3.6裸鼠皮下成瘤和原位种植转移实验SW620W+组细胞皮下呈瘤能力与SW620N1组细胞相比明显减弱,差异具有显著性(F=35.819,P<0.001);SW620W+组细胞与SW620N1组细胞相比发生肝肠转移的能力明显减弱。1.4结直肠癌中WTX基因调控相关信号通路的初步研究通过 Western blot 检测 β-catenin、E-cadherin、Vimentin 在 WTX 基因过表达后的表达情况。结果显示:WTX基因过表达后β-catenin表达量明显下降,E-cadherin、Vimentin表达没有明显改变。2.抑癌基因WTX在胃癌中的作用及机制初步研究2.1胃癌及其配对正常组织中WTX蛋白表达的免疫组化检测WTX在胃癌与正常胃组织中表达显著不同,二者WTX表达比较具有明显差异(p<0.01)。并且WTX表达降低与胃癌组织学分期、淋巴结转移和预后呈明显负相关(p<0.01)。2.2 WTX基因在不同转移潜能胃癌细胞系和胃癌及配对正常胃组织中的表达分析。荧光定量PCR检测3种胃癌细胞系以及43对配对胃癌组织标本中WTX基因的表达。结果显示:以MGC803为对照组,MGC803与BGC823细胞之间WTX基因mRNA的表达差异有统计学意义(P<0.01),MGC803与MGC823细胞之间WTX基因mRNA的表达差异无统计学意义(P=0.942)。Western blot结果显示,WTX蛋白在MGC803中的表达低于MGC823、BGC823。癌旁正常组织中WTX基因的表达量明显高于配对癌组织中WTX基因的表达,且差异具有显著性(t=-4.731,p<0.01);Western blot结果显示,WTX在正常组织中呈高表达趋势,在癌组织中呈低表达趋势。结论1、WTX基因在结直肠癌细胞株中表达下调;2、过表达WTX基因能够抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移,可能是候选结直肠癌抑癌基因及治疗靶点;3、WTX基因的抑制结直肠癌作用可能与抑制β-catenin表达有关;4、WTX基因在胃癌组织和细胞系中表达下调,其作用机制有待于进一步研究。