猪繁殖与呼吸综合征病毒两种快速诊断方法的建立与初步研究

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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种高度传染性疫病,又称“蓝耳病”,本病以妊娠母猪的繁殖障碍(后期流产、死胎、木乃伊胎、弱胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病(间质性肺炎)为主要特征。该病自从1987年首次在美国发现以来,迅速传播至全世界养猪发达的国家与地区,给养猪业造成了巨大的经济损失。   本研究主要采用美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒SX-1株作为阳性对照,选取其保守的N蛋白基因中一段高度保守的基因序列为模板,设计了4条RT-LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种快速检测PRRSV的RT-LAMP诊断方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为1×10-7ng/μL,其敏感性比常规RT-PCR高104倍,且比较稳定,与常规RT-PCR的符合度达87%,判定检测结果时不需要借助昂贵的仪器设备,仅需加入1μL橙红色核酸染料就可以进行判断,颜色变绿判定为阳性,仍保持橙红色判定为阴性。RT-LAMP可以快速、直观、准确地检测PRRSV,是一种适合猪场现地应用的检测方法。   运用柠檬酸三钠还原氯金酸方法,制备胶体金颗粒,最终选取直径约25nm的颗粒作为标记物,将纯化的PRRSV单抗与胶体金颗粒标记,最适标记浓度约为12μg/ml,用喷膜仪将其两者结合物均匀喷至玻璃纤维膜上,并于硝酸纤维素膜(NC膜)上分别喷上PRRSV单抗(T线)和抗鼠IgG(C线),初步制成诊断PRRSV抗原的快速诊断试纸条,此方法的建立为我国进行PRRS抗原的检测和流行病学调查提供了一种快速简便的血清学方法。
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