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植物光呼吸代谢是通过Rubisco加氧酶活性与光合作用代谢紧密偶联,对光合碳循环起到调节作用;光呼吸也能调节细胞内的H2O2含量和氧化还原当量,在应对生物和非生物胁迫中发挥功能。乙醇酸氧化酶（Glycolate oxidase,GLO）和过氧化氢酶（Catalase,CAT）是光呼吸途径中的二个关键酶。水稻中的GLO由GLO1和GLO4共同编码形成寡聚体酶,其催化的反应是H2O2的主要产生源。H2O2作为重要信号分子,在植物的生长发育和逆境适应中扮演重要角色。CAT负责清除H2O2,本实验室的前期研究证明水稻叶片中的CAT与GLO存在互作关系,并暗示GLO-CAT互作/解离的动态变化可能作为体内H2O2含量变化潜在的调控开关。本研究采用双分子荧光互补（BiFC）、荧光共振能量转移（FRET）等技术鉴定GLO-CAT的互作区域和互作位点,并筛选鉴定GLO-CAT互作/解离的调控因子;同时,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术和同工酶谱分析探究GLO1/GLO4的生理功能差异及其与CAT在生理状态中互作的区别。获得的主要研究结果如下:1.GLO-CAT互作区域和位点的鉴定研究实验室前期利用酵母双杂交验证GLO和CAT互作的实验未获得成功,可能的原因是互作需要特定的亚细胞环境（如过氧化物体）。在本实验中,我们采用BiFC技术进行GLO1和CATC的蛋白截断实验,首先把GLO1分为GLO11-260和GLO1261-369两段进行实验,发现只有GLO1261-369区段能够与CAT发生互作,当截取GLO11-359区段与CAT进行共转化时,同样能发生互作。该结果说明GLO261-359区段存在影响GLO和CAT互作的结构域或者关键氨基酸。2.GLO-CAT互作/解离调节因子的鉴定H2O2含量变化会引起植物的抗氧化系统扰动,进而传递信号并和植物激素介导的病原菌抗性相关。我们首先利用BiFC技术筛选到能够抑制GLO-CAT互作的物质水杨酸（SA）和儿茶酚,发现抑制效果随着SA和儿茶酚浓度的增加而增强。BiFC技术的特点是灵敏度高,不可逆,可以检测到很弱的蛋白互作信号,但无法研究其可逆的生理过程,而FRET技术用于生物学的研究,可以反映二个蛋白之间是否存在直接互作以及互作的亲和力大小（和蛋白之间距离有关）,同时也可以进行实时动态检测。为了获得SA和儿茶酚诱导GLO-CAT互作解离的直接证据,我们利用FRET开展进一步研究。首先确定GLO-CAT互作的FRET效率为17%左右,而阴性对照和阳性对照的FRET效率分别为5%和32%左右,本实验结果表明GLO-CAT之间存在直接互作但亲和力较弱;进一步利用分子内FRET系统验证SA诱导GLO-CAT互作解离的过程,结果表明:对于完成转化的水稻原生质体,孵育7h后添加SA并继续孵育4h,这时FRET效率为8%左右;而孵育3h后再添加SA继续孵育到11h的FRET的效率为12%左右;对照组未经SA处理,FRET效率约为18%左右。上述结果表明SA可能引起了GLO-CAT的可逆解离。3.GLO-CAT互作/解离与H2O2含量的关系SA可以调节GLO-CAT互作/解离,为了研究该生理过程与植物体内H2O2含量变化的关系,我们利用离体水稻叶片进行DAB染色实验,发现SA和乙醇酸能够协同诱导H2O2含量的升高,但Western blot结果显示SA处理并未引起GLO和CAT蛋白水平的变化。此结果表明SA可能是在翻译后修饰水平上调节GLO-CAT互作/解离,进而引起H2O2含量的升高。4.基于CRISPR/Cas9突变材料研究GLO和CAT之间的关系4.1 OsGLO1和OsGLO4的CRISPR/Cas9纯合突变材料的生理指标测定及表型观测利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,获得了水稻基因OsGLO1和OsGLO4的纯合突变体,分别编号为:GLO1-7、GLO1-25、GLO1-19、GLO4-39、GLO4-12,其中GLO1-7和GLO1-25突变类型相同,发生一个碱基的插入,GLO1-19发生18bp的碱基缺失,GLO4-39和GLO4-12是在两靶点之间发生340bp的缺失。我们首先进行OsGLO1和OsGLO4突变体的GLO酶活测定,相对于野生型,GLO1-25的酶活下调约67%,GLO1-19的酶活下调约57%,而GLO4-39的酶活只下调了20%;进一步的GLO同工酶谱分析表明,OsGLO1和OsGLO4突变体在同工酶谱上对应的蛋白活性条带消失,表明OsGLO1和OsGLO4基因打靶成功（GLO抗体失效,未进行western blot分析）;qRT-PCR结果显示当敲除OsGLO1或OsGLO4时,不会引起另外一个基因的转录水平变化,说明OsGLO1和OsGLO4在转录水平上可能不存在相互调控。表型方面,二种突变体均出现了植株矮化和整株叶片下垂的表型,并且在高光高温条件下,上述表型更为明显。4.2突变体植株中的H2O2含量及CAT酶活分析取OsGLO1和OsGLO4突变体的叶片进行DAB染色,结果显示相对于WT,GLO1-25、GLO1-19和GLO4-39的染色程度都明显变浅;测定OsGLO1和OsGLO4突变体的CAT酶活,其中GLO4-39的CAT酶活提高了2530%,而GLO1-25和GLO1-19却略有下调趋势,在810%之间。CATC是水稻光呼吸代谢关键酶且在叶片中的转录水平远高于CATA和CATB,而qRT-PCR结果显示二个突变体中,CATC的转录水平无明显差异。水稻体内存在的5条GLO同工酶,其中3条由GLO1和GLO4共同组成的异寡聚体所占比例较大,已知正常情况下OsGLO1的转录水平明显高于OsGLO4,且GLO1和GLO4都能够和CAT发生互作,结合以上结果推测GLO1主要参与GLO的酶活组成,而GLO4可能主要负责与CAT的互作,参与H2O2含量的调控。