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目的:肾母细胞瘤（Wilms tumor,WT）是儿童最常见的肾脏恶性肿瘤,恶性程度很高。虽然手术结合化疗在改善WT预后方面起到了一定作用,但是术后复发和化疗耐药患儿的治疗依然是一个难题。在分子生物学水平上加深对WT的认识和理解,探索WT肿瘤细胞恶性生物学行为的调控分子及其调控机制,不但能够对患者的预后提出可靠依据,还能为WT的精准治疗提供新的策略。RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）是细胞中一类重要的蛋白质。它种类繁多,在各种恶性肿瘤中的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。它们通过识别特定的RNA结构域与RNA相互作用,广泛参与到RNA的剪切、转运、序列编辑、胞内定位及翻译控制等多个转录后调控过程。MEX3A是RBP的一种,该基因是人类MEX3家族成员之一,能够通过泛素化介导m RNA降解,对很多肿瘤细胞的增殖、迁移及凋亡都具有调控作用。有学者发现,MEX3A的DNA拷贝数在WT组织中显著上调,提示MEX3A可能参与调控WT的发生。微小RNA（micro RNA,mi RNA）是近年来发现的一类小的（19-25个核苷酸）单链非编码RNA,其通过序列特异性结合到信使RNA（messenger,m RNA）的编码区或非编码区发挥调控作用。大约有2500个mi RNAs控制数千个生理和病理过程的基因,同时也调控着肿瘤细胞的恶性生物学行为。MEX3A的表达在一些肿瘤中受到mi RNA的调控已经得到证实,但WT中调控MEX3A起主要作用的mi RNA尚不明确。Hsa-let-7b-5p是人类癌症中研究最多的mi RNA之一,在多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用。利用TCGA、TARGET数据库预测,发现Hsa-let-7b-5p与MEX3A存在靶向结合位点且在WT中显著低表达。然而,Hsa-let-7b-5p在WT中的表达及作用机制尚需实验证实。因此,本研究拟探索RBP中MEX3A表达在TW细胞恶性生物学行为的影响,以及WT细胞中Hsa-let-7b-5p对MEX3A的调控作用。研究方法:第一部分:利用产生有效疗法的研究肿瘤数据库（Therapeutic applied research to generate effective therapies,TARGET）和基因表达综合数据库（Gene expression omnibus,GEO）获取WT基因表达数据和相关临床资料。在GEO数据库中鉴定RNA结合蛋白（RNA-binding protein,RBP）的差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）,从TARGET训练队列数据集中获得RBP预后相关基因。随后,应用单变量、LASSO回归和多变量Cox回归分析建立RBP预后相关模型。最后,在TARGET验证队列数据集上验证了该模型的预后价值。第二部分:1)收集2010年至2018年于盛京医院手术的WT组织石蜡切片及患儿临床信息,利用免疫组化检测MEX3A的表达水平,分析MEX3A的不同表达水平对WT患儿临床特征的影响。2)合成并纯化3个MEX3A si RNA片段和一个阴性对照（Negative control,NC）,瞬时转染到WT细胞中,利用CCK-8法和FITC Annexin V/PI双染法检测细胞增殖和凋亡情况。3)利用慢病毒质粒转染并筛选出稳定低表达MEX3A的WT细胞,进行细胞周期检测并与对照组比较。第三部分:1)结合数据库和网站预测Hsa-let-7b-5p可能与MEX3A存在靶向结合位点,进一步通过双荧光素酶报告证实证实了我们的推测。2)构建过表达Hsalet-7b-5p和过表达MEX3A的慢病毒质粒及其对照组,根据需要转染WT细胞,筛选出稳定过表达Hsa-let-7b-5p、同时过表达MEX3A和Hsa-let-7b-5p的WT细胞。利用MTT试验、TUNEL细胞凋亡试验、RI细胞周期检测,来观察Hsa-let-7b-5p及MEX3A在WT细胞增殖、凋亡和细胞周期的调控作用。研究结果:第一部分:49个基因被预测为RBP预后相关的DEGs。随后,确定19个RBP相关基因作为WT患者预后的标志,建立预后模型（CPEB2、AFF3、MEX3B、EZH2、RBPMS、CPEB4、HNRNPA0、MRPS6、CRYZ、BARD1、BRCA1、NOP56、TCERG1、TLR3、RBM47、PURG、SRSF12、SPATS2、MEX3A）。然后,Kaplan-Meier（KM）曲线、受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC曲线）的曲线下面积（Area under roc curve,AUC值）和Cox回归分析验证了19个RBP相关基因模型是独立于其他临床特征的新的、重要预后标志物。高危评分的WT患者存在较差的生存结果。预后模型时间依赖ROC曲线下面积TARGET训练组为0.855,TARGET验证组为0.668,预后模型良好。我们在风险评分和其他临床特征的基础上建立WT患者生存率预测的列线图,列线图对WT预后具有很强的预测能力。生物学功能分析显示肿瘤相关通路丰富。第二部分:对病例切片的免疫组化分析证实在MEX3A高表达的肿瘤患儿生存率明显低于MEX3A低表达患儿（P＜0.05）。随后,课题组利用CCK-8试验和FITC Annexin V/PI凋亡检测发现抑制MEX3A的细胞增殖减弱,细胞凋亡显著增加。其机制可能与提高细胞周期蛋白securin、cyclin B1和cyclin A的蛋白水平有关。利用慢病毒转染质粒得到了稳定抑制表达的MEX3A细胞,随后的细胞周期检测证实,抑制MEX3A可以使G0/G1期细胞增加,S期细胞的比例降低。总之,MEX3A通过促进WT的恶性生物学行为实现其促癌作用。第三部分:双荧光素酶实验证实Hsa-let-7b-5p与MEX3A存在靶向结合位点。我们利用慢病毒转染细胞的方法成功转染了过表达Hsa-let-7b-5p和同时过表达MEX3A及Hsa-let-7b-5p的WT细胞及其对照组,筛选出稳定转染的细胞。接下来的实验证实,过表达Hsa-let-7b-5p可以抑制MEX3A的表达,抑制WT细胞的增殖,促进细胞凋亡,同时影响肿瘤的细胞周期,使S期细胞比例减少。在过表达Hsa-let-7b-5p的同时过表达MEX3A可以补救过表达Hsa-let-7b-5p对WT细胞的影响。结论:RNA结合蛋白相关基因的表达水平可能成为WT的治疗和预防提供了新的预后标志物和潜在的治疗靶点。作为一种RBP,MEX3A的表达情况影响患儿生存率。MEX3A还可促进WT细胞的恶性生物学行为。因此,MEX3A是一种促癌因子,可能成为未来肿瘤分子治疗的靶点。Hsa-let-7b-5p与MEX3A的m RNA存在靶向结合和调控关系。Hsa-let-7b-5p通过调节MEX3A的作用影响肿瘤细胞生物学行为。利用Hsa-let-7b-5p抑制MEX3A可能是一种潜在的预防和治疗肾母细胞瘤的方法。