目的:胃癌是世界上最常见恶性肿瘤之一,其死亡率在肿瘤中排名第二位,我国每年约有300,000人死于胃癌。尽管胃癌诊断及治疗已取得较大进步,但仍有诸多胃癌病人在诊断时已处于晚期,且预后差。Long non-coding RNA（lnc RNA）是一类长度大于200bp的非编码RNA,其在转录沉默、转录激活、染色体修饰、核内运输等生物学过程中具有重要的作用。Lnc RNA通过多种作用途径和方式调节靶基因和靶蛋白的表达,从而影响细胞功能。二甲双胍作为治疗2型糖尿病的一线口服药物,具有副作用少、价格低、降糖效果好等许多优点。近年来,相关研究发现二甲双胍除了能够治疗糖尿病外,还具有潜在的抗癌作用,既可以降低患癌风险,又可以延长癌症病人的生存时间。在本研究中,我们在胃癌细胞系中加入不同浓度的二甲双胍并且控制二甲双胍对胃癌细胞的作用时间,发现二甲双胍对胃癌细胞具有抑制作用。进一步利用lnc RNA芯片技术,研究二甲双胍通过调节lnc RNA以达到抑制胃癌细胞功能的作用机制。研究结果为理解二甲双胍抗癌作用机制提供了新的思路,为二甲双胍抗胃癌作用提供新的研究方向。材料与方法:一、细胞获取及培养胃癌细胞系AGS来源于美国模式培养物集存库（American type culture collection,ATCC）,SGC-7901来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。两种细胞培养于37℃,5%CO₂及饱和湿度的培养箱。二、二甲双胍对胃癌细胞半抑制浓度的确定将一定浓度梯度的二甲双胍作用于胃癌AGS细胞和SGC-7901细胞48小时,然后利用酶标仪测定450nm波长处的吸光度。利用GraphPad Prism 5.0软件绘制IC₅₀曲线并计算IC₅₀的值。三、迁移和侵袭实验根据二甲双胍对胃癌细胞的IC₅₀值,设定0mM,10mM,20mM,40mM四种不同浓度二甲双胍作用于AGS和SGC-7901细胞系,使用Transwell小室检测细胞迁移能力的变化。使用Transwell小室结合Matrigel胶,用于检测细胞的侵袭能力。以上两组实验至少进行3次重复。四、细胞增殖实验细胞增殖实验利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂检测,在细胞接种于新的96孔培养皿2小时后,根据实验前设定的实验方案,在每个孔中加入不同浓度的二甲双胍,分别于0小时、24小时、48小时、72小时取出培养的细胞,在加入10μL CCK-8试剂,利用酶标仪检测在450nm波长处的吸光度。根据各个孔的吸光度值绘制细胞增殖曲线,每组至少进行3次重复实验。五、细胞周期及细胞凋亡检测实验细胞周期检测实验利用细胞周期试剂盒进行（南京凯基生物）。首先将细胞消化,然后重新收集,用70%的预冷乙醇固定,然后使用PI染料染色,4℃避光反应后,使用流式细胞仪检测。细胞凋亡检测实验使用Annexin V-APC细胞凋亡试剂盒进行（南京凯基生物）,首先将细胞消化,然后重新收集,加入Binding Buffer液,使细胞固定,然后加入AnnexinV-APC及PI染料染色,最后使用流式细胞仪检测。六、芯片检测及lncRNA筛选将AGS细胞在20m M二甲双胍作用72小时后,分别将药物处理后的细胞和未处理的细胞用TRIzol试剂提取,并用干冰送至上海伯豪生物技术有限公司,利用安捷伦芯片检测在不同处理后lncRNA和mRNA的差异表达。根据表达倍数变化（Fold change,FC）和P值筛选侯选lncRNA。七、TCGA,Oncomine,UALCAN数据库分析利用TCGA数据库分析H19在胃癌和正常胃组织中的表达是否有差异,以及与临床病理资料等因素的相关性。利用Oncomine在线数据库分析与正常胃组织相比,不同类型胃癌组织中H19的相对表达量。利用UALCAN数据库分析H19表达高低与病人预后的关系。八、RNA提取、反转录及实时定量PCR二甲双胍作用后的胃癌细胞均用TRIzol试剂提取,使用微量分光光度计测RNA浓度及纯度,若结果A260/280值在1.9-2.0之间表示RNA纯度较高。然后使用Takara反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录,使用Takara荧光染料及LightCycler^?480 II Real-time PCR仪进行实时定量PCR反应。采用2^-ΔΔCT法分析数据结果。九、慢病毒载体及稳定表达细胞系构建根据NCBI网站提供的H19序列,在上海吉玛基因公司合成目的lncRNA,并构建敲减载体。在AGS和SGC-7901细胞系中,进行细胞转染,并用嘌呤霉素进行筛选、传代,在显微镜下观察其荧光表达,并提取细胞RNA,反转RNA及实时定量PCR检测其转染效率。经多次传代后荧光持续表达且转染效率持续升高,即稳定敲减细胞系构建成功。十、裸鼠体内转移成瘤实验将4周龄的雌性BALB/c-nu裸鼠随机分成4组,经鼠尾静脉注射1×10⁶胃癌细胞,在注射后2周,对实验组小鼠,按照体重经腹腔予以注射二甲双胍溶液,每天一次,每周注射6天,共注射2周。对照组予以生理盐水注射。于腹腔注射二甲双胍药物治疗结束后,行PET-CT检测,观察小鼠肺部转移瘤情况。然后将小鼠处死,解剖肺部,并做石蜡病理切片及HE染色,镜下观察转移灶数量。结果:一、二甲双胍能够抑制胃癌细胞的迁移、侵袭和增殖迁移和侵袭实验结果显示,应用二甲双胍可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭,且呈浓度依赖性,即随着二甲双胍浓度的增加,抑制作用逐步增强。细胞增殖实验显示,二甲双胍可以抑制细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性,即随着作用时间的延长和浓度的升高,抑制作用逐步增强。二、细胞周期及细胞凋亡检测实验结果细胞周期检测实验结果显示,二甲双胍可以将胃癌细胞周期阻滞在G₁期。细胞凋亡检测实验结果显示,二甲双胍可以引起胃癌细胞的早期和晚期凋亡,且具有剂量相关性,即二甲双胍浓度越高,造成细胞凋亡的比例越多。三、二甲双胍作用胃癌细胞AGS后lncRNA的差异表达LncRNA芯片结果提示共有693个差异表达的lncRNA,其中包含407个上调的lncRNA和286个下调的lncRNA。下调的lncRNA的变化倍数明显大于上调的lncRNA,利用实时定量PCR验证芯片结果,提示lnc RNA H19在二甲双胍作用后下降显著,且符合芯片检测结果。四、检测二甲双胍通过下调H19抑制胃癌细胞功能在AGS和SGC-7901细胞中敲减H19后,细胞功能实验结果提示:敲减H19后可以抑制AGS和SGC-7901细胞的迁移、侵袭能力,在此基础上,加入二甲双胍并没有进一步抑制AGS和SGC-7901细胞的迁移、侵袭能力,表明二甲双胍可能是通过下调H19抑制AGS和SGC-7901的细胞迁移和侵袭能力。五、体内实验检测二甲双胍通过H19抑制胃癌细胞的转移能力小鼠体内实验结果提示,用二甲双胍治疗后,小鼠肺部的转移瘤数量明显减少。敲减H19的胃癌细胞在肺内的转移能力减弱,在此基础上加入二甲双胍,肺部转移瘤的数量并没有进一步减少。这些结果提示二甲双胍在体内可能通过下调H19抑制胃癌细胞转移能力。结论:1、二甲双胍可以抑制胃癌细胞的生长,抑制细胞周期,促进凋亡,抑制迁移侵袭能力。2、H19在胃癌组织中高表达,而且与病人的pT分级和pTNM分期呈正相关。3、二甲双胍可以使胃癌细胞中的H19下调。4、二甲双胍可以通过下调H19抑制胃癌细胞的迁移、侵袭能力。5、二甲双胍可以通过下调H19抑制胃癌细胞在体内形成转移瘤。