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近年来，由于抗生素滥用和缺乏新型抗菌药物，细菌耐药性急剧上升，严重危害公众健康。据估计，每年有7万患者死于耐药菌感染，细菌耐药性已成为全世界最大的公共卫生问题之一。抗菌肽(AMPs)是针对多种病原体(包括细菌，真菌和病毒)的非特异性防御系统的第一道防线，几乎存在于所有生物中。与传统抗生素相比，抗菌肽靶向细菌细胞膜，作用机制独特，被认为是最有前途的传统抗生素替代品。
天然抗菌肽Oreoch-2是从罗非鱼中分离出的含有25个氨基酸残基的两亲性阳离子抗菌肽，具有突出的α-螺旋结构，多肽序列为FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR。Oreoch-2具有抗菌、抗癌、参与免疫调节和促进伤口愈合等多种生物活性，商业应用前景广阔。本论文主要包含两部分内容:抗菌肽Oreoch-2的合成及工艺研究;Oreoch-2类似物的设计、合成与生物活性评价。
第一部分:Oreoch-2作为被广泛研究的多肽，其化学合成均是基于固相合成仪完成，到目前为止，还未有专利或文献对其方法进行报道。而固相合成法投料比高，产品纯度低，纯化困难，生产成本高。因此，我们借鉴了一种新型可溶性疏水载体辅助的液相多肽合成法合成Oreoch-2。该方法结合了固相与液相合成法的最佳性能，其优点是所有反应都是均相反应，可通过TLC法进行实时监测;所有反应操作方法简便，仅通过简单结晶即可达到纯化目的，避免了杂质对接下来反应的干扰。我们根据Oreoch-2序列的结构特点，将长肽链分成4个片段，分别为T-F1:Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag;F2-Fmoc:Fmoc-Lys(Boc)-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-OH;F3-Fmoc:Fmoc-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-OH;F4-Boc:Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-Ile-Ile-Gly-OH。以2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇作为载体，使用Fmoc化学法分别合成这4个片段，然后将F2-Fmoc、F3-Fmoc和F4-Boc依次偶联至T-F1上，得到C末端带有载体的全保护多肽，最后通过裂解多肽链上的保护基和载体，并经制备液相纯化得到Oreoch-2产品，总共经历了58步反应。然后，我们对Oreoch-2的合成工艺进行了优化研究，主要考察了反应条件、投料比和催化剂种类等对反应收率和产品纯度的影响，得到了Oreoch-2的最佳合成工艺路线。
(1)投料比、有机碱以及反应温度对C末端氨基酸与载体间酯化反应的影响:对于T-F1，反应温度40℃，有机碱为DMAP、氨基酸和DIC的投料比分别为1.5eq和3eq为最佳;对于F2-Fmoc，反应温度为室温，有机碱为DMAP，氨基酸投料比为1.2eq为最佳。
(2)后处理方式:将原结晶溶剂乙腈调整为含20％水的乙腈，减少了乙腈用量，降低了合成成本;在合成T-F1的每步脱保护反应后处理时，将反应液pH值由7调为6，改变了产物结晶状态，使收率大幅度提高;针对F3-Fmoc和F4-Boc中黏度较大的中间体，将产物与硅藻土不分离，使混合物直接投下一步反应，不但提高了收率还节省了THF用量，减少了“三废”的产生。
(3)含组氨酸的F2-Fmoc和F4-Boc:裂解载体时，TFA用量由1％分别减少为0.8％和0.7％，减弱溶液的酸性环境，有效避免了组氨酸侧链保护基三苯甲基的脱落，使收率分别由86.5％和81.3％提高到95.3％和91.6％，产品纯度分别由78.45％和67.35％提高到98.25％和97.51％。
(4)片段间的偶联体系:使用HATU和HOAt偶联F2-Fmoc，DMT-MM偶联F3-Fmoc和F4-Boc，得到的Oreoch-2粗品总收率和纯度最佳，分别达到47.3％和43.46％。
我们将优化后的路线应用于抗菌肽Oreoch-2的全合成，得到的粗品经制备液相纯化后，Oreoch-2的纯度高达97.29％，纯化收率为41.7％。我们首次将新型可溶性疏水载体辅助的液相多肽合成法应用于Oreoch-2的合成，并成功建立了一条简捷的合成工艺路线。该方法操作简单、产品纯度高、成本低廉。另外，我们还根据多肽合成中遇到的中间体黏度大和氨基酸侧链保护基不稳定等技术难题进行了改进和优化，使该方法的应用范围更加广泛，这也为Oreoch-2类似物的研究奠定了良好基础。
第二部分:针对Oreoch-2溶血性大以及肽链过长等缺点，我们以Oreoch-2为先导化合物，通过生物信息预测软件，采取截断策略设计、合成了6个Oreoch-2类似物(ZN-1～ZN-6)，并对其结构进行了表征。在此基础上，对Oreoch-2类似物进行了系统的生物活性评价。该项研究旨在缩短肽链，寻找活性片段，提高抗菌活性或降低溶血性，得到更具潜力的新抗菌肽。
体外抗菌活性研究表明，ZN-5(22肽)和ZN-6(18肽)抗敏感革兰氏阳性菌活性最好，均表现出了与母体肽Oreoch-2相当，甚至更好的抗菌活性。例如，ZN-5抗敏感金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的活性十分显著(MIC值均为1.5μM)，抗敏感化脓性链球菌活性良好(MIC=6.2μM)，均比Oreoch-2提高了一倍;ZN-5抗短小芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的活性与Oreoch-2相当。ZN-6抗敏感金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的活性优异，MIC值均为1.8μM，比Oreoch-2提高了一倍;抗枯草芽孢杆菌(MIC=3.5μM)、短小芽孢杆菌(MIC=1.8μM)和敏感化脓性链球菌(MIC=14.2μM)的活性与Oreoch-2相当。ZN-5和ZN-6抗表皮葡萄球菌的活性均显著高于环丙沙星。另外，ZN-4抗枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、表皮葡萄球菌和敏感化脓性链球菌的活性与Oreoch-2相当，尤其抗短小芽孢杆菌的活性最好，MIC值为1.5μM。另一方面，ZN-5具有最好的抗耐甲氧西林(MIC=3.1μM)和耐青霉素(MIC=6.2μM)金黄色葡萄球菌的活性，并与Oreoch-2相当。令人惊讶的是，ZN-5和ZN-6抗耐药化脓性链球菌的活性显著，MIC值分别为12.3μM和28.4μM，而Oreoch-2则无抗菌活性。从上述结果中不难发现，Oreoch-2序列中过多的阳离子氨基酸以及其高疏水性影响了其抗菌效力。体外杀菌活性研究表明，ZN-5和ZN-6呈现杀菌模式，是典型的杀菌剂，与Oreoch-2相同。杀菌动力学研究表明，ZN-5的杀菌效果呈浓度和时间依赖性，在4×MIC浓度下，6h内即可将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌全部杀死。稳定性研究表明，ZN-5和ZN-6对酸、碱、热和生理盐稳定且略优于Oreoch-2。另外，ZN-5和ZN-6对小鼠红细胞的溶血性远低于Oreoch-2，在16×MIC浓度下，最高溶血率仅为4.84％，比Oreoch-2降低了88％，是类似物的一大突破。这也提示在一定程度上高溶血性是高疏水性所致。细菌的生物膜形成抑制研究表明，ZN-5和ZN-6对敏感金黄色葡萄球菌生物膜的形成表现出显著的抑制作用，尤其ZN-5，在亚浓度2μg/mL时其抑制率就达到了46.0％。经其处理过的敏感金黄色葡萄球菌，通过TEM可直接观察到细胞膜完整性遭到破坏，细胞内容物释放，出现了明显的离散。这说明ZN-5和ZN-6是通过破坏细菌细胞膜而发挥抗菌作用的。
总之，我们首次将新型可溶性疏水载体辅助的液相多肽合成法用于Oreoch-2的合成，并成功建立了一条简捷的合成工艺路线。该方法操作简便、产品纯度高、成本低廉。在此基础上，我们以Oreoch-2为先导化合物，采取截断策略设计、合成了6个Oreoch-2类似物，并对其体外抗菌活性、杀菌活性、杀菌动力学、稳定性、溶血性和细菌生物膜形成抑制进行了系统评价。研究结果表明，ZN-5和ZN-6是较为理想的新型抗菌肽，完全符合本论文缩短肽链，提高抗菌活性并降低溶血性的设计思想，可对其进行系统的成药性评价。
天然抗菌肽Oreoch-2是从罗非鱼中分离出的含有25个氨基酸残基的两亲性阳离子抗菌肽，具有突出的α-螺旋结构，多肽序列为FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR。Oreoch-2具有抗菌、抗癌、参与免疫调节和促进伤口愈合等多种生物活性，商业应用前景广阔。本论文主要包含两部分内容:抗菌肽Oreoch-2的合成及工艺研究;Oreoch-2类似物的设计、合成与生物活性评价。
第一部分:Oreoch-2作为被广泛研究的多肽，其化学合成均是基于固相合成仪完成，到目前为止，还未有专利或文献对其方法进行报道。而固相合成法投料比高，产品纯度低，纯化困难，生产成本高。因此，我们借鉴了一种新型可溶性疏水载体辅助的液相多肽合成法合成Oreoch-2。该方法结合了固相与液相合成法的最佳性能，其优点是所有反应都是均相反应，可通过TLC法进行实时监测;所有反应操作方法简便，仅通过简单结晶即可达到纯化目的，避免了杂质对接下来反应的干扰。我们根据Oreoch-2序列的结构特点，将长肽链分成4个片段，分别为T-F1:Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag;F2-Fmoc:Fmoc-Lys(Boc)-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-OH;F3-Fmoc:Fmoc-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-OH;F4-Boc:Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-Ile-Ile-Gly-OH。以2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇作为载体，使用Fmoc化学法分别合成这4个片段，然后将F2-Fmoc、F3-Fmoc和F4-Boc依次偶联至T-F1上，得到C末端带有载体的全保护多肽，最后通过裂解多肽链上的保护基和载体，并经制备液相纯化得到Oreoch-2产品，总共经历了58步反应。然后，我们对Oreoch-2的合成工艺进行了优化研究，主要考察了反应条件、投料比和催化剂种类等对反应收率和产品纯度的影响，得到了Oreoch-2的最佳合成工艺路线。
(1)投料比、有机碱以及反应温度对C末端氨基酸与载体间酯化反应的影响:对于T-F1，反应温度40℃，有机碱为DMAP、氨基酸和DIC的投料比分别为1.5eq和3eq为最佳;对于F2-Fmoc，反应温度为室温，有机碱为DMAP，氨基酸投料比为1.2eq为最佳。
(2)后处理方式:将原结晶溶剂乙腈调整为含20％水的乙腈，减少了乙腈用量，降低了合成成本;在合成T-F1的每步脱保护反应后处理时，将反应液pH值由7调为6，改变了产物结晶状态，使收率大幅度提高;针对F3-Fmoc和F4-Boc中黏度较大的中间体，将产物与硅藻土不分离，使混合物直接投下一步反应，不但提高了收率还节省了THF用量，减少了“三废”的产生。
(3)含组氨酸的F2-Fmoc和F4-Boc:裂解载体时，TFA用量由1％分别减少为0.8％和0.7％，减弱溶液的酸性环境，有效避免了组氨酸侧链保护基三苯甲基的脱落，使收率分别由86.5％和81.3％提高到95.3％和91.6％，产品纯度分别由78.45％和67.35％提高到98.25％和97.51％。
(4)片段间的偶联体系:使用HATU和HOAt偶联F2-Fmoc，DMT-MM偶联F3-Fmoc和F4-Boc，得到的Oreoch-2粗品总收率和纯度最佳，分别达到47.3％和43.46％。
我们将优化后的路线应用于抗菌肽Oreoch-2的全合成，得到的粗品经制备液相纯化后，Oreoch-2的纯度高达97.29％，纯化收率为41.7％。我们首次将新型可溶性疏水载体辅助的液相多肽合成法应用于Oreoch-2的合成，并成功建立了一条简捷的合成工艺路线。该方法操作简单、产品纯度高、成本低廉。另外，我们还根据多肽合成中遇到的中间体黏度大和氨基酸侧链保护基不稳定等技术难题进行了改进和优化，使该方法的应用范围更加广泛，这也为Oreoch-2类似物的研究奠定了良好基础。
第二部分:针对Oreoch-2溶血性大以及肽链过长等缺点，我们以Oreoch-2为先导化合物，通过生物信息预测软件，采取截断策略设计、合成了6个Oreoch-2类似物(ZN-1～ZN-6)，并对其结构进行了表征。在此基础上，对Oreoch-2类似物进行了系统的生物活性评价。该项研究旨在缩短肽链，寻找活性片段，提高抗菌活性或降低溶血性，得到更具潜力的新抗菌肽。
体外抗菌活性研究表明，ZN-5(22肽)和ZN-6(18肽)抗敏感革兰氏阳性菌活性最好，均表现出了与母体肽Oreoch-2相当，甚至更好的抗菌活性。例如，ZN-5抗敏感金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的活性十分显著(MIC值均为1.5μM)，抗敏感化脓性链球菌活性良好(MIC=6.2μM)，均比Oreoch-2提高了一倍;ZN-5抗短小芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的活性与Oreoch-2相当。ZN-6抗敏感金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的活性优异，MIC值均为1.8μM，比Oreoch-2提高了一倍;抗枯草芽孢杆菌(MIC=3.5μM)、短小芽孢杆菌(MIC=1.8μM)和敏感化脓性链球菌(MIC=14.2μM)的活性与Oreoch-2相当。ZN-5和ZN-6抗表皮葡萄球菌的活性均显著高于环丙沙星。另外，ZN-4抗枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、表皮葡萄球菌和敏感化脓性链球菌的活性与Oreoch-2相当，尤其抗短小芽孢杆菌的活性最好，MIC值为1.5μM。另一方面，ZN-5具有最好的抗耐甲氧西林(MIC=3.1μM)和耐青霉素(MIC=6.2μM)金黄色葡萄球菌的活性，并与Oreoch-2相当。令人惊讶的是，ZN-5和ZN-6抗耐药化脓性链球菌的活性显著，MIC值分别为12.3μM和28.4μM，而Oreoch-2则无抗菌活性。从上述结果中不难发现，Oreoch-2序列中过多的阳离子氨基酸以及其高疏水性影响了其抗菌效力。体外杀菌活性研究表明，ZN-5和ZN-6呈现杀菌模式，是典型的杀菌剂，与Oreoch-2相同。杀菌动力学研究表明，ZN-5的杀菌效果呈浓度和时间依赖性，在4×MIC浓度下，6h内即可将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌全部杀死。稳定性研究表明，ZN-5和ZN-6对酸、碱、热和生理盐稳定且略优于Oreoch-2。另外，ZN-5和ZN-6对小鼠红细胞的溶血性远低于Oreoch-2，在16×MIC浓度下，最高溶血率仅为4.84％，比Oreoch-2降低了88％，是类似物的一大突破。这也提示在一定程度上高溶血性是高疏水性所致。细菌的生物膜形成抑制研究表明，ZN-5和ZN-6对敏感金黄色葡萄球菌生物膜的形成表现出显著的抑制作用，尤其ZN-5，在亚浓度2μg/mL时其抑制率就达到了46.0％。经其处理过的敏感金黄色葡萄球菌，通过TEM可直接观察到细胞膜完整性遭到破坏，细胞内容物释放，出现了明显的离散。这说明ZN-5和ZN-6是通过破坏细菌细胞膜而发挥抗菌作用的。
总之，我们首次将新型可溶性疏水载体辅助的液相多肽合成法用于Oreoch-2的合成，并成功建立了一条简捷的合成工艺路线。该方法操作简便、产品纯度高、成本低廉。在此基础上，我们以Oreoch-2为先导化合物，采取截断策略设计、合成了6个Oreoch-2类似物，并对其体外抗菌活性、杀菌活性、杀菌动力学、稳定性、溶血性和细菌生物膜形成抑制进行了系统评价。研究结果表明，ZN-5和ZN-6是较为理想的新型抗菌肽，完全符合本论文缩短肽链，提高抗菌活性并降低溶血性的设计思想，可对其进行系统的成药性评价。