论文部分内容阅读
研究背景与目的:慢性肾脏病(CKD)常伴有高脂血症,后者是加速CKD进展的重要因素。肾小球足细胞作为肾小球滤过屏障的重要组成部分,是一个高度分化的细胞,其一旦损伤、坏死、凋亡、脱落后不能再生,均可导致蛋白尿,而持续的蛋白尿是CKD持续进展的重要危险因素。我们既往研究表明,棕榈酸(PA)可以诱导足细胞凋亡,然而其具体机制尚不清楚。在本研究中,我们研究了 PA诱导足细胞凋亡的经典的信号通路。方法:用PA(150μmol/L)刺激已分化的条件永生化小鼠足细胞,采用CCK8检测PA对足细胞的细胞毒活性,采用油红“O”、BODIPY荧光染色以及电镜观察PA刺激下足细胞内脂质集聚情况;流式细胞术及电镜检测足细胞凋亡情况;用JC-1染色检测PA刺激下足细胞内线粒体膜电位变化情况,分别用mitoTracker染色和电镜观察线粒体结构变化;Western印迹检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved caspase-3 及 FADD、Caspase-8、Bid、Cleaved caspase-9、Cyt 的表达;共聚焦分别观察Bax、Cyt c与mitoTracker的共定位。采用mitoSOX染色观察PA诱导下足细胞线粒体内ROS的产生水平;采用线粒体靶向抗氧化剂mitoTEMPO预处理足细胞,观察PA诱导下足细胞线粒体内ROS的水平变化及足细胞凋亡情况。结果:与对照组相比,PA刺激可增加足细胞内的脂质集聚,呈浓度依赖性诱导足细胞死亡和凋亡。本文研究了两种主要的经典的凋亡信号通路(死亡受体通路和线粒体通路)是否参与了 PA诱导的足细胞凋亡的发生,结果发现,死亡受体通路相关蛋白FADD、Caspase-8和Bid蛋白表达水平在此过程中无显著变化。同时,PA处理后,可诱导足细胞Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低以及Bax易位到线粒体。进一步研究发现,PA刺激可诱导足细胞线粒体损伤,触发细胞色素c从线粒体释放到细胞质,并呈浓度依赖性增加Cleaved caspase-9,Cleaved caspase-3和PARP蛋白表达水平。我们采用mitoSOX染色,发现PA诱导下足细胞线粒体内ROS产生增多,采用线粒体靶向抗氧化剂mitoTEMPO预处理后,则可以明显改善PA诱导的足细胞凋亡。结论:本研究表明,PA可通过线粒体途径而非死亡受体通路诱导足细胞凋亡,线粒体产生的ROS在这一过程中发挥了重要作用。