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研究背景目的 在新生儿细菌性脑膜炎的病因中，大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)是主要致病菌之一。E.coli经血行播散到脑，并穿过血脑屏障(BBB)致病。但大肠杆菌如何穿过BBB其机理尚不清楚。迄今已克隆鉴定了一些E.coli脑微血管内皮细胞(BMEC)侵袭基因，如ompA，ibeA，ibeB和yijP基因等，但这些基因编码蛋白的功能仍不清楚。 yijp基因，也称为f577或IBE23基因，其ORF为1734bp，推断的编码产物的分子量为66.6KD，该蛋白参与大肠杆菌侵袭BMEC的机制不清。本研究旨在表达和纯化yijP蛋白，并观察其对人脑微血管内皮细胞(HBMEC)某些生物学特性的影响，以期为阐明E.coli穿过BBB的机制积累新资料。 研究方法 1．yijP融合蛋白的表达和提纯： ①应用受体菌M15(pREP4、pQE-yijP)表达氨基末端带有6个His·tag的yijP融合蛋白； ②通过亲和层析(Ni-NTA agarose)方法分离纯化yijP融合蛋白； ③透析法进行yijP融合蛋白的再折叠。 2．yijP蛋白质的功能分析： ①MTT实验检测yijP蛋白对人脑微血管内皮细胞(HBMEC)增殖的抑制作用； ②细胞计数法分析 yijP蛋白对 HBMEC的生长抑制作用； ③光学显微镜下观察HBMEC的形态变化； ④利用荧光显微镜观察细胞核的改变； ⑤流式细胞仪检测亚二倍体峰； ⑤琼脂糖凝胶电泳观察 DNA ladder； ①Western blotting方法检测 caspase－3的活性片段； ③采用t－检验进行统计学分析。 研究结果 1．6 X HIS·tag－yijP蛋白质的表达与提纯： 大量扩增M15bREPo囚－”）菌体纲胞。将IW’n诱导后 0一 h的细胞裂解物进行 SDS—PAGE分析，在 41 KD处可见一条逐渐增高的蛋白条带，这与推断的m·tag－九P融和蛋白分子量相符。蛋白经过Ni－NTA Agwtse亲和层析和再折叠3DS－PAGE分析表明亲和层析提纯与复性后的蛋白条带位置与细胞裂解物中的位置一致。 2．yijP蛋白质功能分析： o rs实验检测结果发现沟 蛋白可引起明显的细胞增殖抑制作用，yiP实验组与对照组存在统牌意义u＜0．05入并存在浓度依赖性。 雕统方法做细胞生长曲线，连续观察发现：从给药后的第16 h开始，＜liP组和对照组出现差异（P＜0．01X 44 h后 tjP组细胞几乎全部死亡。说明yijP蛋白对HBMEC的毒性作用存在时间依赖性。 udrnl yijP蛋白与 HBMEC孵育 16 h后，相差显微镜和荧光显微镜下细胞表现出凋亡特征。 ④流式细胞仪可在正常二倍体峰前检测出一个亚二倍体峰， ·2·同时 GO／Gl期细胞J期和 GZ／M期细胞所占比例下降。 ⑤DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA阶梯状条带。 ⑤Western hi。ting可检测到一p。e－3的活性片段。 结 论 1．成功地表达并提纯了大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白yije。 2．对yijn蛋白功能分析表明，oe蛋白对体外培养的人脑微血管内皮细胞有较强的毒性作用，提示yijP的编码产物可能是一种毒素。 3．yiP蛋白的毒性效应可能在于诱导脑血管内皮细胞发生凋亡。