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背景
大肠埃希菌的耐药问题目前已成为世界范围的难题，菌株自身特点、抗生素的应用等诸多因素都可影响其耐药性的产生。抗生素是临床上预防和治疗大肠埃希菌感染的主要手段，但抗生素的不规范使用导致病原菌产生越来越严重的耐药性。近年来，多重耐药菌株的出现使大肠埃希菌的耐药问题更加严峻，同时动物源大肠埃希菌的耐药情况也越发严重。产生超广谱β-内酰胺酶是耐药大肠埃希菌的重要耐药机制，产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌通常对头孢他啶和头孢噻肟等头孢菌素类耐药性较高，而对β-内酰胺酶抑制剂较敏感。但临床实践中，产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌对β-内酰胺酶抑制剂耐药阳性率可超过10%，为临床治疗带来很大困难，直接导致感染相关的死亡率的增加，这些结果表明可能存在其他分子机制参与产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的耐药性的产生。因此对耐药大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶的相关机制研究十分必要。
目的
1.本研究利用蛋白质组学和非靶标代谢组学的方法，检测产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和敏感大肠埃希菌之间的差异蛋白和差异代谢物，以揭示产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的蛋白表达谱和代谢趋势的变化，为在蛋白质和代谢物水平上对该细菌耐药相关的研究提供科学的依据。
2.通过生物信息学方法对两组之间差异蛋白和差异代谢物结果进行关联分析，找到与耐药大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶显著相关的信号通路，为进一步筛选相关的重要基因奠定基础。
3.找到与耐药大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶显著相关的重要基因。
4.通过基因敲除、构建过表达质粒等及技术处理实验菌株，并检测实验菌株处理前后产超广谱β-内酰胺酶的量的变化，以揭示差异基因对耐药大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶的影响，为对产生超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的治疗及抗生素的研发提供新的方向。
方法
1.我们利用蛋白组学方法筛查产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和敏感大肠埃希菌的差异表达蛋白。选取10例产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和10例敏感大肠埃希菌，细菌培养后，每份样本各取等量，10例敏感对照组混为一份，定为A组，10例产酶实验组混为一份，定为B组，每组充分混匀后，各均分成三份。通过串联质量标签蛋白组学方法筛选两组之间的差异蛋白谱，并对结果进行基础数据处理、层次聚类分析、KEGGPathway分析、差异蛋白网络构建分析。
2.利用非靶标代谢组学方法筛查产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和敏感大肠埃希菌的差异代谢物。选取10例产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和10例敏感大肠埃希菌，采用超高效液相色谱-质谱方法进行检测，并进行主要成份分析、正交偏最小二乘法-判别分析、正交偏最小二乘法-判别分析置换检验、差异代谢物筛选、差异代谢物与相关代谢途径归因分析。
3.对实验两组之间的差异蛋白和差异代谢物的结果通过生物信息学方法进一步分析，首先通过Spearman相关系数分析差异代谢蛋白和差异代谢物的相关性，再通过KEGG数据库进行差异蛋白和差异代谢物的相关性通路分析，构建差异蛋白和代谢物的相关性网络，通过富集分析得到与耐药大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶显著相关的通路。
4.采用靶标代谢组学方法对显著富集的嘌呤代谢通路中的2-脱氧腺苷一水合物、2,6-二羟基嘌呤和黄嘌呤进行进一步的定量验证分析。同时综合考虑MS2评分、p值、VIP和代谢物-蛋白质相互作用等因素，结合靶标蛋白组学分析结果与非靶标代谢组学数据结果，根据两者的吻合情况，评估分析方法的可靠性。
5.对实验菌株进行全基因框架测序，并结合关联分析结果中显著富集的通路进行综合分析，筛选出差异基因，并通过实时荧光定量PCR技术对差异基因进行验证，结果显示丙酮酸代谢通路中的GLO1基因高表达，构建GOL1基因敲除和过表达菌株，并采用Elisa方法分别检测超广谱β-内酰胺酶的产量变化。
结果
1.串联质量标签蛋白组学分析发现两组之间有1553个差异表达的蛋白质，并通过功能富集性分析发现差异蛋白功能显著富集在53个GO项(p＜0.05)，其中29项与生物学过程相关，7项与细胞成份相关，10项与分子功能相关。
2.通过非靶向代谢组学分析，共筛查出差异代谢物1165个，其中上调差异代谢物350个，下调代谢物815个。基于差异代谢物的途径分析显示了两组之间的82种不同的代谢途径。正离子模式下显著差异代谢通路为嘌呤代谢通路、精氨酸与脯氨酸代谢通路、丙酮酸代谢通路、烟酸盐和烟酰胺通路、维生素B6通路、链霉素生物合成通路等，负离子模式下的显著差异代谢通路为不饱和脂肪酸的生物合成通路、烟酸盐和烟酰胺通路、泛酸盐和辅酶A生物合成、嘧啶代谢通路、甘油磷脂通路、甘油脂通路等。
3.代谢组学与蛋白质组学数据的相关性分析结果表明，有18条通路与大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶显著相关，关联分析得到的差异通路有嘌呤代谢通路、精氨酸与脯氨酸代谢通路、丙酮酸代谢通路、烟酸盐与烟酰胺代谢通路、不饱和脂肪酸的生物合成通路、泛酸盐和CoA生物合成通路、嘧啶代谢通路等。
4.通过超高效液相色谱多反应监测质谱方法验证嘌呤代谢途径中的三种代谢物的含量，即对2-脱氧腺苷一水合物、2,6-二羟基嘌呤和黄嘌呤进行进一步的定量验证分析，MRM分析结果与非靶标代谢组学数据结果吻合性良好，说明本研究非靶标代谢分析方法的可靠性。
5.综合分析全基因组框架分析结果和上述18差异通路，筛选出差异基因，这些基因包括add、punA、guaD、apaH、adk、prdA、speG、Acedeacetylase、PRODH、codA、hchA、frdA、GLO1、ppnK、ilvE、pandecarboxylase、VNN、tdk、deoA、tmk，通过实时荧光定量PCR分析了上述候选基因mRNA在标准菌ATCC25922、对照组敏感大肠埃希菌及产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的表达情况，结果显示这些mRNA在标准菌ATCC25922和对照菌表达基本无差异，speG、acetylputrescinedeacetylase、GLO1及pantothenoylcysteinedecarboxylase在产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌相对表达量显著增加，其他基因相对表达量降低。
6.构建GLO1过表达及敲除菌种，并通过Elisa验证了GLO1基因表达情况对β内酰胺酶亚型产量的影响，共分析了10个亚型，包括β-内酰胺酶BES型、CTX-M1型、CTX-M2型、OXA1型、OXA2型、OXA10型、PER型、SHV型、TEM型及VEB型。结果显示，GLO1基因表达水平的变化只对PER型β-内酰胺酶有影响，而对其他类型的β-内酰胺酶无显著影响。标准菌ATCC25922、对照菌大肠埃希菌中GLO1过表达后其PER型β-内酰胺酶表达显著增加，GLO1敲除的产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌PER型β-内酰胺酶显著降低，这种降低可被转入GLO1过表达质粒后逆转。这些结果表明GLO1基因表达水平的变化与大肠埃希菌中PER型β-内酰胺酶表达量具有显著的相关性。
结论
1.实验组产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的蛋白质谱显著改变，总体呈现下调趋势，且差异蛋白参与到与生物学过程、细胞成份及分子功能相关的各个方面。
2.实验组产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌与对照组敏感大肠埃希菌相比，代谢物以下调为主。
3.GLO1与大肠埃希菌的耐药性显著相关，其对耐药性的作用是通过增加PER型β-内酰胺酶产量介导的。
大肠埃希菌的耐药问题目前已成为世界范围的难题，菌株自身特点、抗生素的应用等诸多因素都可影响其耐药性的产生。抗生素是临床上预防和治疗大肠埃希菌感染的主要手段，但抗生素的不规范使用导致病原菌产生越来越严重的耐药性。近年来，多重耐药菌株的出现使大肠埃希菌的耐药问题更加严峻，同时动物源大肠埃希菌的耐药情况也越发严重。产生超广谱β-内酰胺酶是耐药大肠埃希菌的重要耐药机制，产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌通常对头孢他啶和头孢噻肟等头孢菌素类耐药性较高，而对β-内酰胺酶抑制剂较敏感。但临床实践中，产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌对β-内酰胺酶抑制剂耐药阳性率可超过10%，为临床治疗带来很大困难，直接导致感染相关的死亡率的增加，这些结果表明可能存在其他分子机制参与产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的耐药性的产生。因此对耐药大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶的相关机制研究十分必要。
目的
1.本研究利用蛋白质组学和非靶标代谢组学的方法，检测产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和敏感大肠埃希菌之间的差异蛋白和差异代谢物，以揭示产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的蛋白表达谱和代谢趋势的变化，为在蛋白质和代谢物水平上对该细菌耐药相关的研究提供科学的依据。
2.通过生物信息学方法对两组之间差异蛋白和差异代谢物结果进行关联分析，找到与耐药大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶显著相关的信号通路，为进一步筛选相关的重要基因奠定基础。
3.找到与耐药大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶显著相关的重要基因。
4.通过基因敲除、构建过表达质粒等及技术处理实验菌株，并检测实验菌株处理前后产超广谱β-内酰胺酶的量的变化，以揭示差异基因对耐药大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶的影响，为对产生超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的治疗及抗生素的研发提供新的方向。
方法
1.我们利用蛋白组学方法筛查产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和敏感大肠埃希菌的差异表达蛋白。选取10例产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和10例敏感大肠埃希菌，细菌培养后，每份样本各取等量，10例敏感对照组混为一份，定为A组，10例产酶实验组混为一份，定为B组，每组充分混匀后，各均分成三份。通过串联质量标签蛋白组学方法筛选两组之间的差异蛋白谱，并对结果进行基础数据处理、层次聚类分析、KEGGPathway分析、差异蛋白网络构建分析。
2.利用非靶标代谢组学方法筛查产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和敏感大肠埃希菌的差异代谢物。选取10例产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和10例敏感大肠埃希菌，采用超高效液相色谱-质谱方法进行检测，并进行主要成份分析、正交偏最小二乘法-判别分析、正交偏最小二乘法-判别分析置换检验、差异代谢物筛选、差异代谢物与相关代谢途径归因分析。
3.对实验两组之间的差异蛋白和差异代谢物的结果通过生物信息学方法进一步分析，首先通过Spearman相关系数分析差异代谢蛋白和差异代谢物的相关性，再通过KEGG数据库进行差异蛋白和差异代谢物的相关性通路分析，构建差异蛋白和代谢物的相关性网络，通过富集分析得到与耐药大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶显著相关的通路。
4.采用靶标代谢组学方法对显著富集的嘌呤代谢通路中的2-脱氧腺苷一水合物、2,6-二羟基嘌呤和黄嘌呤进行进一步的定量验证分析。同时综合考虑MS2评分、p值、VIP和代谢物-蛋白质相互作用等因素，结合靶标蛋白组学分析结果与非靶标代谢组学数据结果，根据两者的吻合情况，评估分析方法的可靠性。
5.对实验菌株进行全基因框架测序，并结合关联分析结果中显著富集的通路进行综合分析，筛选出差异基因，并通过实时荧光定量PCR技术对差异基因进行验证，结果显示丙酮酸代谢通路中的GLO1基因高表达，构建GOL1基因敲除和过表达菌株，并采用Elisa方法分别检测超广谱β-内酰胺酶的产量变化。
结果
1.串联质量标签蛋白组学分析发现两组之间有1553个差异表达的蛋白质，并通过功能富集性分析发现差异蛋白功能显著富集在53个GO项(p＜0.05)，其中29项与生物学过程相关，7项与细胞成份相关，10项与分子功能相关。
2.通过非靶向代谢组学分析，共筛查出差异代谢物1165个，其中上调差异代谢物350个，下调代谢物815个。基于差异代谢物的途径分析显示了两组之间的82种不同的代谢途径。正离子模式下显著差异代谢通路为嘌呤代谢通路、精氨酸与脯氨酸代谢通路、丙酮酸代谢通路、烟酸盐和烟酰胺通路、维生素B6通路、链霉素生物合成通路等，负离子模式下的显著差异代谢通路为不饱和脂肪酸的生物合成通路、烟酸盐和烟酰胺通路、泛酸盐和辅酶A生物合成、嘧啶代谢通路、甘油磷脂通路、甘油脂通路等。
3.代谢组学与蛋白质组学数据的相关性分析结果表明，有18条通路与大肠埃希菌产生超广谱β-内酰胺酶显著相关，关联分析得到的差异通路有嘌呤代谢通路、精氨酸与脯氨酸代谢通路、丙酮酸代谢通路、烟酸盐与烟酰胺代谢通路、不饱和脂肪酸的生物合成通路、泛酸盐和CoA生物合成通路、嘧啶代谢通路等。
4.通过超高效液相色谱多反应监测质谱方法验证嘌呤代谢途径中的三种代谢物的含量，即对2-脱氧腺苷一水合物、2,6-二羟基嘌呤和黄嘌呤进行进一步的定量验证分析，MRM分析结果与非靶标代谢组学数据结果吻合性良好，说明本研究非靶标代谢分析方法的可靠性。
5.综合分析全基因组框架分析结果和上述18差异通路，筛选出差异基因，这些基因包括add、punA、guaD、apaH、adk、prdA、speG、Acedeacetylase、PRODH、codA、hchA、frdA、GLO1、ppnK、ilvE、pandecarboxylase、VNN、tdk、deoA、tmk，通过实时荧光定量PCR分析了上述候选基因mRNA在标准菌ATCC25922、对照组敏感大肠埃希菌及产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的表达情况，结果显示这些mRNA在标准菌ATCC25922和对照菌表达基本无差异，speG、acetylputrescinedeacetylase、GLO1及pantothenoylcysteinedecarboxylase在产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌相对表达量显著增加，其他基因相对表达量降低。
6.构建GLO1过表达及敲除菌种，并通过Elisa验证了GLO1基因表达情况对β内酰胺酶亚型产量的影响，共分析了10个亚型，包括β-内酰胺酶BES型、CTX-M1型、CTX-M2型、OXA1型、OXA2型、OXA10型、PER型、SHV型、TEM型及VEB型。结果显示，GLO1基因表达水平的变化只对PER型β-内酰胺酶有影响，而对其他类型的β-内酰胺酶无显著影响。标准菌ATCC25922、对照菌大肠埃希菌中GLO1过表达后其PER型β-内酰胺酶表达显著增加，GLO1敲除的产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌PER型β-内酰胺酶显著降低，这种降低可被转入GLO1过表达质粒后逆转。这些结果表明GLO1基因表达水平的变化与大肠埃希菌中PER型β-内酰胺酶表达量具有显著的相关性。
结论
1.实验组产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的蛋白质谱显著改变，总体呈现下调趋势，且差异蛋白参与到与生物学过程、细胞成份及分子功能相关的各个方面。
2.实验组产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌与对照组敏感大肠埃希菌相比，代谢物以下调为主。
3.GLO1与大肠埃希菌的耐药性显著相关，其对耐药性的作用是通过增加PER型β-内酰胺酶产量介导的。