肺癌是目前全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一，占全部恶性肿瘤的16％，全部癌症死亡的28％。其发病率有明显上升趋势，在我国肺癌的发病率也逐年上升，并且已经成为我国城市人口癌症死亡的首要原因。据统计，我国2004-2005肺癌的死亡率为30．83／10万，居第一位。非小细胞肺癌(N。n small cell 1ung cancer，NscLc)是肺癌的主要病理类型，占80％，其中肺腺癌约占总病例的35％40％。尽管过去20年中第三代化疗药物及靶向治疗药物不断涌现，其生存期却无明显改善。非小细胞肺癌的5年生存率仅为14％，其主要原因是不能早期诊断和化疗耐药。70％的NscLc在发现时已属晚期，失去手术治疗的机会，所以大部分病例是以化疗为主的综合治疗，但目前晚期非小细胞肺癌肺癌的标准一线治疗含铂两药方案有效率仅40％左右。本实验入组病例40例回顾性分忻，有效率为35％也证实了这一点。因此寻找能够预测非小细胞肺癌化疗敏感／耐药性的生物标志物，指导临床个体化用药具有重要意义。常见能够预测肿瘤化疗的敏感性的方法有：1．体内药敏实验；2．体外药敏实验；3．肿瘤标志物的检测；4．耐药基因的检测。但目前预测化疗敏感性的方法都有不少缺点，仍然不够理想，主要存在与临床相关性较差，费时较长等问题。理想的方法直该：1．与临床相关性好，敏感性、特异性较好；2．简单、快速、费时短；3．标本易获取，可多样化；4．可筛选多种药物；5．可操作性强，能标准化；6．费用低廉，易于临床推广。无论是耐药基因的突变、表达水平的改变，或者是药物泵改变还是抗凋亡途径调整出现的耐药，最终的执行者都是蛋白质。从蛋白质水平来寻找能够预测肿瘤化疗耐药的的生物标志物有着重要的意义。蛋白质组(pr。te。me)指的是一个基因组(gen。me)或一种细胞／组织所表达的全部蛋白质(pr。tein)。蛋白质组学(pr。te。mics)就是从整体的角度，分忻动态变化的蛋白质组成、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之表面增强激光解忻电离飞行时间质谱(surface enhanced 1aser des。rpti。ni。nizati。n time。f flight mass stectr。metry，sELDI TOF Ms)将结合了能量吸收分子后的蛋白质在激光的激发下电离，带有电荷的蛋白质在加速电场的作用下，不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需的时间不同，带有正电荷的蛋白质离子束在到达检测器的一瞬间，电子倍增器将产生瞬时电流，转换成蛋白质的相对含量。它将蛋白质芯片和表面增强激光解忻电离飞行时间质谱有机地结合在一起，具有样品用量小、操作简便、灵敏度高、高通量等优点。通过配套生物信息学软件，可以寻找到差异蛋白，建立诊断模型。是寻找血清等蛋白生物标志物的理想手段。SELDI TOF Ms技术目前已广泛用于多种疾病的早期诊断及指导治疗，在筛选肿瘤特异性蛋白质中的直用最为广泛，也显得最为重要。但由于技术的局限性，发现的蛋白峰，无法知道其序列，下游的研究工作困难。c¨np。rt技术的磁珠可以分离纯化血清的中低丰度小分子量蛋白。MALDI TOF Ms是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M／z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。TOF／TOF对于Ms／Ms模式可通过第一级TOF选择母离子进入高能碰撞池中碰碎，然后进入第二级TOF重新被加速并被分忻，不仅能够检测蛋白质的肽谱，同时可以检测肽序列。研究目的：本实验拟通过联合利用sELDI TOF Ms技术、c¨np。rt磁珠、MALDI TOT／TOF Ms技术，寻找非小细胞肺癌患者血清中能够预化疗敏感／耐药的蛋白质，建立预测非小细胞肺癌化疗敏感／耐药性的模型；并分离纯化蛋白，进行质谱鉴定。材料和方法：1．病例选择2009年2月至2009年9月，40例就诊于广州医学院附属肿瘤医院的非小细胞肺癌患者，行标准含铂类两药方案化疗2周期后按REcIsT评价方法，分为化疗有效组(cP+PR)和化疗无效组(sD+PD)。2．血清样品处理和保存入组患者用干燥试管抽取清晨空腹静咏血3～5m1，4℃15)00转／分，离心10分钟，提取血清，置于80℃冰箱保存。3．sELDI TOF Ms检测将样本加到芯片上以后，经过一段时间的结合反直，各种蛋白质通过特定的表面基团吸附于蛋白芯片上，然后用缓冲液或水洗去不结合的非特异分子，再加上能量吸收分子溶液，把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分忻。以A11 in。ne标准蛋白质芯片作为外参照。4．统计学分忻4.临床资料比较，化疗敏感组和耐药组间的差异性，采用sPssl3．O，计数资料采用卡方检验，非正态分布计量资料的采用非参数秩和检验，正态分布的计量资料采用t检验，P<O．05为差别有统计学意义。4．2用Pr。tein chip software 3．1和Bi。marker wizard(BMW)软件，根据方差分忻原理计算化疗敏感组与耐药组间相同质荷比的蛋白质峰值表达差异的P值。4．3根据分类决策村原理，用数据挖掘软件Bi。marker Patternssortware(BPs)对数据分组和相关性进行线性分忻，建立诊断模型。5．cLINPORT MB wcx 2磁珠分离纯化小分子量蛋白6．MALDI TOF TOF Ms检钡0完全冻干的样品重新用含0．I％TFA的30％的乙腈溶解，然后使用美国直用生物系统公司4800 plus MALDI TOE TOE Analyzer串联飞行时间质谱仪进行分忻。获得的一级和二级质谱数据使用GPS Explore(软件版本号：V3．6，美国直用生物系统公司)软件进行分忻，分忻后的每一个样品的一级和二级质谱数据再整合成一个文件，使用MASCOT(V2．1，Matrix Science，London，U．K)搜库软件对本地数据库进行检索及NCBI blast，鉴定蛋白质。结果：1、非小细胞肺癌化疗敏感组和耐药组两组比较临床特征无明显差异。2、SELDI TOF MS检测共发现有效蛋白峰100个。3、非小细胞肺癌肺癌含铂两药化疗敏感组14例对耐药组26例，发现P<0．05的差异蛋白23个。4、非小细胞肺癌肺癌铂类和紫杉醇类化疗敏感组7例对耐药组18例，发现P<0．05的差异蛋白19个。5、肺腺癌顺铂和多烯紫杉醇化疗敏感组4例对耐药组12例，发现P<0．05的差异蛋白31个。6、三个分组中m／z为3193．14Da，3263．61 Da，3397．71 Da，5902．89 Da，6087．73Da，9993．63 Da，2950．49 Da，6108．91 Da，4993．65 Da的9个蛋白峰，均在耐药组中高表达。7、联合m／z为3193．14Da与3263．61 Da的差异蛋白建立预测模型可预测非小细胞肺癌标准含铂类方案化疗敏感／耐药性，其敏感性90．23％和特异性98．56％。8、C1inport磁珠分离纯化血清中低丰度小分子量蛋白可行。9、对m／z为3193．14Da，3263．61Da进行MALDI TOF／TOF MS鉴定序列为TCSIEAHVAGLPPIAASNSAETTASAVTGAAR，NAANKPAAPTDALPVAAPSAPHIDIGIKDADRK搜索数据库发现多个匹配蛋白质，无特异性。结论：1、SELDI TOF MS技术是寻找非小细胞肺癌标准含铂类方案化疗敏感／耐药血清标志物的有效工具。2、利用SELDI TOE MS技术和生物信息学及软件，可以建立新的化疗敏感性3、非小细胞肺癌患者的血清蛋白质表达水平在标准含铂类方案化疗敏感组患者和耐药组中差异有显著性。4、m／z为3193．14Da，3263．61 Da，3397．71 Da，5902．89 Da，6087．73 Da，9993．63 Da，2950．49 Da，6108．91 Da，4993．65 Da的9个蛋白峰在非小细胞肺癌使用铂类和紫杉醇类化疗或肺腺癌使用顺铂和多烯紫杉醇中的耐药组均高表达5、联合m／z为3193．14Da与3263．61 Da的差异蛋白建立预测模型可预测非小细胞肺癌标准含铂类方案化疗敏感／耐药性，其敏感性90．23％和特异性98．56％。6、clinport磁珠分离纯化血清中低丰度小分子量蛋白可行。7、对m／z为3193．14Da，3263．61Da进行MALDI TOF／TOF MS鉴定序列为TCSIEAHVAGLPPIAASNSAETTASAVTOiAR，NAANKPAAPTDALPVAAPSAPHIDIGIKDADRK搜索数据库发现多个匹配蛋白质，无特异性。