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研究背景:小檗碱(berberine,BBR),别名黄连素,异喹啉生物碱类,提取于中国传统中草药黄连、黄柏等。中外大量研究证实小檗碱具有调节肠道菌群、降低血浆葡萄糖、调节脂代谢紊乱、减轻体重、促进胰岛素分泌、改善胰岛素抵抗、抑制细胞凋亡等能力,已然成为2型糖尿病、肥胖、代谢综合征等疾病新药防治的新宠。但小檗碱对脂毒性损伤的胰岛β细胞功能的影响及其潜在的分子机制尚不清楚。第十号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(Phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome10,PTEN)是一种抑癌基因,具有脂质及蛋白质双特异性磷酸酶活性,在多种肿瘤的发生发展中发挥关键作用。研究表明,PTEN不但参与细胞凋亡、增殖、迁徙过程,还调节PI3K-AKT信号通路。本课题组前期研究表明PTEN增加会抑制AKT信号通路激活,参与游离脂肪酸(FFAs)造成的胰岛β细胞损伤;而阻断PTEN表达可改善FFAs引起的β细胞损害;提示PTEN可能可以作为2型糖尿病治疗的新靶点。本实验观察小檗碱在β细胞脂性凋亡中的相关作用,进一步明确小檗碱拮抗脂毒性损伤的胰岛β细胞的可能分子机制,并观察PTEN是否参与该过程。目的:观察小檗碱和PTEN在FFAs造成β细胞损伤中的作用,分析小檗碱抗糖尿病、保护胰岛β细胞功能的可能分子机制。方法:实验一:小檗碱对高浓度棕榈酸(pa)条件下胰岛βtc3细胞增殖、凋亡的影响。采用mtt法筛查小檗碱对βtc3细胞增殖起保护作用的浓度,流式细胞技术对比各组细胞凋亡情况;进一步找到小檗碱对游离脂肪酸介导的βtc3细胞功能改变起保护作用的合适浓度与作用时间。实验二:放射免疫法测定小檗碱对脂毒性损伤的胰岛βtc3细胞胰岛素分泌的影响。实验三:分子机制研究:westernblot法检测小檗碱干预与否对脂毒性损伤βtc3细胞氧化应激相关蛋白pten、akt、p-akt以及凋亡相关蛋白bax、bcl-2、active-caspase3表达水平变化的影响。结果:1.mtt结果表明:(1)0.001-1μmol/l小檗碱作用βtc3细胞24、48、72h,对细胞增殖有不同程度促进作用(与对照组比较p<0.05);从24h增加到72h后,0.001-1μmol/l小檗碱对βtc3细胞增殖的促进作用增加,而1μmol/l浓度细胞增殖下降,10μmol/l及以上浓度则抑制细胞增殖(与对照组相比p<0.01),并呈浓度依赖性。(2)pa(0.2-1.0mmol/l)对βtc3细胞增殖的抑制作用具有浓度以及时间依赖性(与对照组比较p<0.05),剂量越高、时间越久,抑制作用越大。2.流式细胞术结果显示:pa孵育βtc3细胞后,pa组细胞凋亡率较对照组明显升高,添加小檗碱处理后细胞凋亡率显著降低(p<0.01)。3.胰岛素分泌结果显示:pa组在5.6、16.7mmol/l葡萄糖刺激下胰岛素分泌较正常对照组显著减少(p<0.001);添加小檗碱后胰岛素分泌回升(p<0.001),但较对照组减少。4.westernblot结果:pa处理βtc3细胞24、48、72h后,pa组的pten、bax、激活型caspase3表达水平显著升高,p-akt、bcl-2水平下降;bbr治疗组pten、bax表达水平较pa组下降,p-akt、bcl-2水平升高(p均<0.01)。结论:bbr可显著减少ffas诱导的β细胞凋亡,促进细胞增殖,改善ffas引起的胰岛素分泌减少;可能的机制为小檗碱抑制ffas引起的pten过表达,降低促凋亡基因bax、active-caspase3表达,促进akt活化并增加抑凋亡基因bcl-2表达;提示PTEN参与了小檗碱减轻游离脂肪酸诱导的β细胞损害过程。