原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)以下简称肝癌，是严重影响人类生存率的常见恶性肿瘤之一，发病率占恶性肿瘤的第五位，病死率占癌肿死因的第三位，每年新发病例大约60万人，大约55％来自于中国，是排在我国第二位的癌症杀手，已经严重威胁我国人民生命健康。对于肝癌的治疗手段比较多样，包括外科手术、肝移植、介入治疗和射频消融等，目前外科手术仍然作为肝癌病人获取长期生存率的主要手段，但是，肝癌术后5年复发率高达70％，其中80％的复发病灶发生在肝脏（肝内转移），主要是由于原发病灶在术前已出现微小转移未被发现，或术中挤压发生播散所致，导致其成为肝癌病人术后死亡的主要原因。因此，预测肝癌转移复发倾向，判断肝癌预后的肿瘤标志物，早期发现复发病灶并进行规范化治疗，提高病人总体生存率，降低死亡率是提高肝癌手术后疗效的重点和难点内容。　　 ATAD2(ATPase family AAA domain-containing protein2)基因，定位于人染色体8q24.13，在一些肿瘤中参与调控染色质动力活性、基因组转录活性和细胞凋亡过程。其编码蛋白质具有两个结构域:AAA区域和溴区结构域(Bromodomain)。AAA区域做为分子伴侣，执行装配、操作、分解蛋白复合物的功能;溴区结构域参与基因转录调控、细胞周期调控、信号转导，其表达异常导致恶性肿瘤发生和发展。深入研究其作用机理将为肿瘤治疗提供新的策略，有望成为新的肿瘤表面标志物和治疗靶点。　　 目的:　　 本研究旨在探讨ATAD2在肝癌中的表达情况、可能的分子调节机制以及与肝癌发生发展、转移及与临床病理学特征的关系，为临床治疗提供新的思路及依据。研究的第一部分我们在细胞和组织水平上检测ATAD2的表达水平，分析其与临床病理学特征的关系;研究的第二部分，通过ATAD2表达沉默细胞株，观察对其增殖和侵袭能力的影响，揭示ATAD2与肝癌发生发展、侵袭转移的关系，探讨ATAD2潜在的临床应用价值。第三部分我们通过生物信息学预测，检测到调控ATAD2的上游miR-372，分析其表达改变对靶基因ATAD2的调控作用。由此探讨miR-372可能通过调控下游ATAD2基因参与肝癌的发生发展，恢复miR-372的表达可能使肝癌的进展受到抑制。　　 方法:　　 一、实验对象　　 2008年1月～2011年6月中国医科大学普外科肝癌患者癌和癌旁配对组织病理切片129例;2011年1月～2012年1月45例肝癌新鲜组织标本;1株正常肝细胞LO2，6株肝癌细胞SMMC7721，QGY-7701，Bel-7402，PLC5，Huh7，HCCLM3，HepG2　　 二、实验方法　　 1.细胞培养:人肝癌细胞株和人正常肝细胞常规培养。　　 2.Real Time PCR检测ATAD2基因mRNA在组织和细胞水平的表达。　　 3.Westem blot检测7株细胞及8对肝癌和癌旁组织中ATAD2蛋白表达。　　 4.免疫组织化学检测肝癌和癌旁组织中ATAD2蛋白表达水平。　　 5.免疫荧光检测ATAD2在肝癌细胞中的定位。　　 6.应用CCK8检测ATAD2沉默表达后肝癌细胞增殖能力。　　 7.应用平板克隆实验检测ATAD2沉默表达后肝癌细胞克隆形成能力。　　 8.应用Transwell实验检测ATAD2沉默表达后肝癌细胞侵袭迁移能力变化。　　 9.应用细胞周期试剂盒检测ATAD2沉默表达后肝癌细胞细胞周期变化。　　 10.应用miRNA agomir及miRNA antagomir瞬时转染，检测靶基因ATAD2表达变化。　　 11.构建ATAD2的3UTR野生型及突变型质粒，分别与miR372质粒共转染293T细胞，应用荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶变化。　　 结果:　　 第一部分ATAD2基因在肝细胞肝癌中的表达及临床意义　　 1.Real Time PCR及Western Blot结果显示，ATAD2在6株人肝癌细胞中的表达水平高于人正常肝细胞LO2，且在高转移细胞株Huh7和HCCLM3表达显著升高。　　 2.45例肝癌组织中有转移肝癌mRNA表达量0.283，未转移肝癌mRNA表达量0.097，均显著高于对应癌旁组织0.059，差异有统计学意义(P＜0.01)。　　 Western Blot结果与PCR结果趋势一致，且在有转移肝癌中ATAD2表达量更高。在129例肝癌组织的免疫组化结果中，83例呈现ATAD2蛋白高表达，46例低表达。ATAD2主要表达在细胞核，细胞浆亦有表达。　　 3.肝癌组织ATAD2表达变化与临床病理因素结果显示，ATAD2表达与转移（P＜0.05）密切相关;而与年龄、性别、肿瘤大小等其他临床病理因素无明显相关(P＞0.05)。　　 第二部分ATAD2基因沉默后对肝癌细胞生物学特性的影响　　 1.选取高表达人肝癌细胞株Huh7和HCCLM3细胞，免疫荧光结果显示ATAD2蛋白表达主要位于细胞核，细胞浆亦有表达。　　 2.沉默表达ATAD2基因，Transwell实验结果显示，两株细胞侵袭及迁移能力下降;CCK8及平板克隆实验表明细胞增殖能力及克隆形成能力下降;细胞周期实验结果显示沉默表达ATAD2基因，细胞周期阻滞于G1/S期。　　 第三部分miR-372对靶基因ATAD2的负调控作用　　 1.生物信息学预测结果提示miR372与靶基因ATAD2的3UTR区域第335-341位点形成互补配对，且该序列在多种属间高度保守。　　 2.Real Time PCR结果显示miR372在肝癌中呈现低表达为29/45(64.4％)。　　 3.45对肝癌组织中，通过Spearman相关分析，miR372与ATAD2基因表达呈现负相关(P=0.0002，r=-0.5237)。　　 4.应用miR-372 agomir上调其表达后，ATAD2在RNA和蛋白水平表达均出现显著下调;应用miR372 antagomir抑制其表达后，ATAD2在RNA和蛋白水平表达均出现显著上调，差异有统计学意义。　　 5.荧光素酶报告基因检测结果显示，ATAD2是miR-372的直接作用靶基因。与共转染突变型(MUT) ATAD2-3-UTR报告基因载体相比，共转染miR-372和ATAD2-3-UTR(WT)报告基因载体时，荧光素酶活性降低(P＜0.05);共转染miR-372和预测靶位点突变载体(MUT)时，荧光素酶活性未见明显改变。　　 结论:　　 1.ATAD2在肝癌细胞及组织中呈高表达，且与肝癌转移密切相关。　　 2.下调ATAD2表达可以抑制肝癌细胞的增殖，使肝癌细胞阻滞于G1/S期，同时也可降低其侵袭转移能力。　　 3.miR-372在肝癌组织中显著低表达。　　 4.生物信息学预测miR-372对ATAD2有负向调控作用，通过共转染及荧光素酶报告基因检测结果证实ATAD2是miR372的靶基因。