由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝炎成为全世界最普通的传染病，HBV慢性感染者超过4亿。国内外在治疗HBV感染研究中，认为HBV的持续感染是造成乙肝慢性化的主要原因，且可导致病情发展、恶化至肝硬化、HBV相关性肝细胞癌。虽然有大量治疗慢性乙肝的药物存在，但是没有真正彻底有效的。 因为天然化合物具有庞大的结构多样性，为筛选出具有抗HBV提供了大量的机会。苯丙氨酸二肽类化合物是从苗族药马蹄金中分离所得的二肽衍生物，马蹄金在民间广泛用于慢性乙肝的治疗，结构如图1所示。 以马蹄金素为母体化合物已设计合成了200个衍生物，经初步筛选确定苯丙氨酸二肽类化合物073、190（Phenylalaninedipeptidecompounds073、190）具有良好的抗乙肝病毒活性，具有二肽结构的抗HBV活性的化合物还没有相关文献和专利报道。因此，本研究从体外和体内两个方面，利用不同的实验模型，观察PDC073、190对乙肝病毒的抑制作用，并对其作用机理进行探讨。 一、体外实验 本实验以HBV基因转染的人肝癌细胞系（HePG2）2．2．15细胞为研究对象，通过体外细胞培养实验测定HBsAg、HBeAg、HBVDNA和cccDNA的含量，明确药物对HBV分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用及对HBVDNA和cccDNA的抑制作用。实验中先通过细胞毒实验确定PDC073、190的最大无毒浓度为50μg·mL—1，然后在最大无毒浓度以下将药物用培养液对倍稀释成50、25、12．5μg·mL—1，对2．2．15细胞进行培养，每4d换同浓度药物培养液；分别收集第4d、第8d以及停药后4d的培养液和2．2．15细胞，分别利用酶联免疫法（ELISA）测定HBsAg、HBeAg含量，普通PCR和荧光定量PCR定性、定量测定细胞HBVDNA和cccDNA的含量，并计算各自的抑制率。实验设恩替卡韦（3μg·mL—1）对照组和1%DMSO细胞对照组。 二、体内实验 本实验以感染了鸭乙肝病毒的北京麻鸭为实验模型，雏鸭经胫静脉注射DHBVDNA阳性鸭血清，每只0．2ml，待DHBV感染雏鸭7d血清检测为阳性后，随机分组，每组6只，灌胃给药，1次/d。PDC073、190分为高、中、低三个剂量组，即0．1、0．05、0．025g·kg—1·d—1三个剂量组，实验设阳性药对照组（拉米夫定0．05g·kg—1·d—1）。在感染后第7d即给药前Od、给药第7d、第14d及停药后第3d，自鸭胫静脉取血，分离血清，—70℃保存待检。取上述待检鸭血清，样品点膜，标记DHBVDNA探针，（血清）斑点杂交，放射自显影膜片斑点检测。以杂交斑点光密度值（OD值）进行自身和组间比较，并作鸭肝病理检查评价，明确药物是否具有抑制DHBVDNA的作用和保肝作用。 三．实验结果 1．苯丙氨酸二肽类化合物073最大无毒浓度为50μg·mL—1，在最大无毒浓度时对HBsAg有明显的抑制作用，第8d时的抑制率为59．3%，半数抑制浓度（IC50）为22．9μg·mL—1，治疗指数（TI）为3．1；但对HBeAg无明显抑制作用，第8d时的抑制率仅为25．5%。 2．苯丙氨酸二肽类化合物190最大无毒浓度为50μg·mL—1，在最大无毒浓度时对HBsAg和HBeAg均有明显的抑制作用，第8d时的抑制率分别为68．9%和62．8%，半数抑制浓度（IC50）分别为22．3μg·mL—1和23．4μg·mL—1，治疗指数（TI）为3．2和3．1。 3．苯丙氨酸二肽类化合物073中、高剂量组（0．05、0．1g·kg—1）能降低DHBV感染鸭血清DHBVDNA水平，给药第7d、第14d及停药后第3d的抑制率与病毒对照组比较，均有极显著性差异（P<0．01），并呈量效关系；低剂量组（0．025g·kg—1）也有一定的疗效，显著性差异（P<0．05，P<0．01）。肝病理镜检结果证实：生理盐水对照组鸭肝细胞的变性坏死较重，而苯丙氨酸二肽类化合物073治疗组（中、高剂量）则较轻。 4．苯丙氨酸二肽类化合物190中、高剂量组（0．05、0．1g·kg—1）能降低DHBV感染鸭血清DHBVDNA水平，给药第7d、第14d及停药后第3d的抑制率与病毒对照组比较，均有极显著性差异（P<0．01），并呈量效关系；低剂量组（0．025g·kg—1）也有一定的疗效，显著性差异（P<0．05，P<0．01）。肝病理镜检结果证实：生理盐水对照组鸭肝细胞的变性坏死较重，而苯丙氨酸二肽类化合物190治疗组（中、高剂量）则较轻。 5．苯丙氨酸二肽类化合物190最大无毒浓度为50μg·mL—1，在最大无毒浓度时对HBVDNA和cccDNA有明显的抑制作用，第8d时分别达到67．5%和67．1%。 综上，苯丙氨酸二肽类化合物073、190无论在体内还是体外都具有十分明显的抗乙肝病毒作用，有望成为一种潜在的治疗乙肝病毒的新型药物。