急性呼吸道感染是导致全世界人类急性疾病和死亡的主要原因之一,其中急性病毒性呼吸道感染是主要病因,占80%。常见呼吸道病毒包括流感病毒（IFV）、呼吸道合胞病毒（HRSV）、冠状病毒（HCoV）、腺病毒（HAdV）和鼻病毒（HRV）等。肺炎支原体（MP）也是引起呼吸道感染的常见病原体。基于下一代测序（NGS）的宏基因组二代测序（Metagenomic next generation sequencing,mNGS）是一项高通量无偏的测序技术,可以同时检测数千种病原体,实现对临床样本中所有微生物的全面分析。mNGS检测病原体主要包括两个部分:实验操作（湿实验）和生物信息学分析（干实验）。湿实验室操作包括样品预处理,核酸提取,文库构建和测序。本研究比较了 NGS样本的预处理方法和核酸扩增方法,为临床呼吸道样本的宏基因组学分析提供技术参考。MP感染与病毒感染的关系尚不清楚,本研究通过对鼻咽抽吸物样本宏基因组学分析,阐明了 MP阳性呼吸道样本的病原谱以及常见呼吸道病毒混合感染情况。另外,通过基因拼接获得了两株HRSV和一株HAdV的全基因组序列,并进行全基因组特征分析,为疾病治疗以及防控策略的制定奠定了基础。本研究主要结果如下:一、用于宏基因组分析的临床呼吸道样本预处理方法比较对临床呼吸道样本mNGS预处理方法和扩增方法摸索,以HAdV和HRV呼吸道鼻咽抽吸物样本为检测模板,经过滤、核酸酶处理和扩增（MDA和SISPA）后,比较不同样本处理后测序结果匹配到HAdV和HRV的reads数百分比、覆盖率和测序深度。结果表明呼吸道样本过滤组HRV和HAdV全基因序列匹配率高于未过滤组,但覆盖率差异不明显。对临床呼吸道样本进行核酸酶预处理可增加HRV和HAdV reads的匹配率和测序深度。对于HAdV和HRV,使用SISPA和MDA扩增后测序结果在病毒匹配率上没有明显差异,但MDA扩增后全基因组覆盖率高于SISPA。对于HAdV,MDA 比 SISPA扩增后的测序深度更为均匀。未经扩增的样本不建议测序。二、支原体感染住院儿童鼻咽抽吸物样本病原谱分析1.本研究中北京地区6岁以下呼吸道感染住院患儿中MP感染率为43.7%,5-6岁儿童MP感染率最高,且无明显季节性流行特点。2.病原谱分析结果显示MP 阳性和阴性呼吸道样本中均检测到多种常见病毒相关序列,匹配到11个病毒科,reads数最多的均为肺病毒科,均有大量reads匹配到指环病毒科相关病毒和噬菌体相关序列。3.Real Time PCR方法检测与MP混合感染的常见呼吸道病毒,83份MP阳性样本中,合并病毒感染共47例（56.63%）,其中单病毒感染38例（45.78%）,双重感染7例（8.43%）,三重感染2例（2.41%）。其中感染IFV（20例,24.1%）最多。102份MP阴性样本中,有66例（64.7%）病毒感染,其中HRSV感染最为常见（21例,20.6%）。4.MP合并病毒感染患者的住院时长、发热时长、血清肌酸激酶同工酶和血液白细胞计数与MP单一感染患者之间均无显著性差异。三、HAdV和HRSV全基因组特征分析1.本研究通过二代测序获得了北京地区的两株HRSV和一株HAdV全基因组序列,两株HRSV均为ON1基因型,HAdV属于B3族。2.Simplot分析两株HRSV全基因组序列G蛋白、F蛋白和L蛋白变异较大。多处位点发生了氨基酸有义突变,有些位点位于P27肽和抗原位点（?）中。两株HRSV F蛋白均有6个N糖基化位点,G蛋白均有3个N糖基化位点。3.基于Penton base、Hexon和Fiber基因,对HAdV进行SNP分析,三基因序列均高度保守。Simplot分析显示HAdV未发生重组事件。结论:1.过滤后样本测序结果优于未经过滤样本;使用核酸酶处理组测序结果比未使用核酸酶处理组结果更好;使用MDA和SISPA扩增后测序结果在病毒的匹配率上没有明显差异。2.采用mNGS技术获得MP 阳性与阴性患儿病原谱。两组reads数最多的病毒科均为肺病毒科,MP阳性样本匹配到HRSV的reads数远高于MP阴性样本,MP阳性组合并IFV感染病例最多。3.获得了北京地区两株HRSV和一株HAdV全基因组序列。两株HRSV在G、F和L蛋白区变异较大;HAdV在三基因序列上均高度保守,未发生重组事件。