在哺乳动物的DNA中,5-甲基胞嘧啶参与许多生物学过程,是一种重要的表观遗传学修饰。最新的研究表明,5-甲基胞嘧啶可以被TET蛋白连续氧化为5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶。产生的5-醛基胞嘧啶和5羧基胞嘧啶可以经由TDG介导的BER修复途径去除并恢复为未修饰的胞嘧啶,因此哺乳动物DNA的主动去甲基化过程可以通过TET蛋白连续地氧化5-甲基胞嘧啶来实现。许多研究表明DNA主动去甲基化与生物体生长发育以及各种生物学过程的调控紧密相关。植物和酵母与哺乳动物一样属于真核生物,其DNA中也可能存在上述修饰胞嘧啶。之前有文章报道植物基因组中存在5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。然而目前,还没有关于植物基因组DNA里存在5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶的报道；而且在酵母基因组中也没有DNA甲基化及其氧化衍生物修饰的决定性证据。此外,仍然缺乏对DNA中四种胞嘧啶修饰同时直接定量分析的相关报道。以上存在的这些问题,主要是因为DNA胞嘧啶修饰的定量检测存在两个难题：首先,DNA中修饰碱基含量极低,在哺乳动物中,5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶在DNA中的含量依次有1-2个数量级的降低,因此很不容易检测到；其次,未修饰的正常碱基与修饰的碱基化学结构很相似,大量的正常碱基会严重干扰修饰碱基的检测,使修饰碱基的检测更加具有挑战性。所以检测基因组DNA中修饰胞嘧啶的方法需要同时具备高灵敏度和高选择性。由于色谱-质谱联用法本身具有很高的灵敏度和选择性,所以在本文研究工作中,我们采用色谱-质谱联用法结合化学衍生化的策略来检测基因组DNA中的甲基化胞嘧啶及其氧化衍生物。化学衍生化能显著地改善色谱-质谱联用法的灵敏度和选择性,很好地解决了上述两个分析难题,为灵敏地检测DNA甲基化胞嘧啶及其氧化衍生物的含量提供了新的思路。我们进一步将建立的分析方法应用在以下几个DNA修饰分析的工作中,并初步探索DNA甲基化胞嘧啶及其氧化衍生物的生理功能。1.发展了一种高灵敏的气相色谱-质谱联用法,系统的检测了19株酵母菌,共计16种酵母菌种的DNA中的5-甲基胞嘧啶含量。证实了酵母DNA中普遍存在着胞嘧啶甲基化修饰。通过进一步实验,我们还发现酵母DNA中的5-mC的含量在酵母不同的生长阶段会发生显著的变化。并且酵母DNA的甲基化水平也会如同哺乳动物那样,可以受到DNA甲基化抑制剂,即5-氮杂胞苷的影响而发生降低。2.我们利用T4β-葡萄糖基转移酶选择性地将葡萄糖分子转移至5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上,形成糖基化的5-羟甲基胞嘧啶,从而显著地增加了5-羟甲基胞嘧啶的亲水性。由于糖基化的5-羟甲基胞嘧啶亲水性更强,能被氨基硅胶通过亲水相互作用选择性地富集,这就克服了用液相色谱-质谱联用法检测5-羟甲基胞嘧啶时会受到大量未修饰核苷干扰的问题,因而消除了液相色谱-质谱联用法分析中的离子抑制,提高了检测的灵敏度和准确性。使用该方法,我们成功地对3种人类细胞系和7种酵母DNA中的5-羟甲基胞嘧啶进行了定量,并在模式生物—酵母DNA中发现5-羟甲基胞嘧啶的存在。3.对于5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶,目前还没有决定性的证据证明植物DNA中存在这两种修饰碱基。基于此,我们发展了一种化学衍生化与液相色谱—串联质谱联用法相结合的策略同时检测植物基因组DNA中的5-醛基脱氧胞苷和5-羧基脱氧胞苷。我们使用吉拉德试剂(GirD、GirT或GirP)将5-醛基脱氧胞苷和5-羧基脱氧胞苷进行衍生化,使之带上易电离基团,显著提高了5-醛基脱氧胞苷和5-羧基脱氧胞苷检测灵敏度(52-260倍)。通过该方法,我们发现在植物的基因组DNA中广泛存在着胞嘧啶醛基化和羧基化这两种修饰。并且我们还发现干旱和盐环境的胁迫可以改变植物DNA胞嘧啶醛基化和羧基化修饰的水平,暗示这两种修饰在植物应答环境胁迫中可能扮演着某种功能角色。4.我们利用2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮将DNA中的5-甲基脱氧胞苷、5-羟甲基脱氧胞苷、5-醛基脱氧胞苷和5-羧基脱氧胞苷同时进行衍生化,极大地改善它们的液相色谱保留行为并且显著提高了它们在电喷雾电离质谱中的检测灵敏度。由此发展出一种可同时高灵敏地检测DNA中四种胞嘧啶修饰的液相色谱-串联质谱联用的方法。使用该方法,我们成功定量了结直肠癌病人癌症部位和癌旁部位组织DNA中的四种胞嘧啶修饰,获得了人类癌症组织DNA胞嘧啶主动去甲基化途径中的全部四种重要的修饰的定量结果,也同时获得癌症组织和癌旁组织这四种DNA胞嘧啶修饰的对比定量结果。与正常组织相比,我们发现在癌症组织DNA中,胞嘧啶羟甲基化、醛基化和羧基化的修饰水平发生下降,暗示这几种DNA修饰可能在癌症的调控中扮演着着某种功能角色。