多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.multocida)是导致中国生猪产业中主要的一种细菌性疾病,主要引起猪肺炎,萎缩性鼻炎。由于P.multocida血清型众多,且各血清型之间的交叉保护尚不明确,因此尚需对P.multocida的抗原类型、免疫机制等进行更深入的研究。本次课题选用OmpA、OmpH、plpP和plpE四个保护性抗原作为研究对象,体外重组表达并配制成亚单位疫苗,以小鼠为实验动物进行免疫攻毒保护试验,为进一步探索、开发猪源多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗研提供资料积累。1、本试验采用PCR方法,以本实验室保存的PmA8.1菌株DNA为模板克隆了OmpA、OmpH、plpP和plpE四个保护性抗原基因,并构建至pET-28(a)载体中,获得了pET28-OmpA、pET28-OmpH、pET28-plpE和pET28-plpP四个重组表达质粒,将体外表达重组蛋白用铝胶佐剂、弗氏佐剂和ISA201佐剂分别配制成亚单位疫苗接种免疫小鼠进行攻毒实验,结果显示,四个重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经诱导表达OmpA、OmpH、plpE均为包涵体表达,plpP无表达。OmpA疫苗组中,ISA201-OmpA攻毒保护率达到了50%;AL-OmpA和弗氏-OmpA的攻毒保护率为16.6%;OmpH疫苗组中,除AL-OmpH的攻毒保护率有16.6%外,其余两个佐剂组的保护率为0;plpE疫苗组中,ISA201-plpE攻毒保护率为100%,其余两个佐剂组的保护率均为90%。2、构建OmpA、OmpH、plpP和plpE四个保护性抗原与大肠杆菌不耐热肠毒素B型亚基(LTB)融合表达载体,将纯化的表达蛋白与佐剂ISA201配制成疫苗接种免疫小鼠,攻毒结果表明,LTB能提高OmpH与plpE蛋白的免疫保护效果,LTB-OmpH融合蛋白的保护率为16.6%,单独构建的OmpH保护率为0。LTB-OmpA融合蛋白保护率为16.6%,与抗原OmpA相比,保护率降低。融合表达的plpP蛋白保护率为33.3%。融合表达的OmpA、OmpH和plpP联合免疫的保护率为16.6%,与LTB-OmpA、LTB-OmpH单独免疫的保护率相当。LTB-plpE融合蛋白的保护率为100%,6只小鼠中仅3只小鼠出现发病症状。综上,本次试验保护性效果最好的抗原是plpE,由ISA201佐剂配制的LTB-plpE与plpE亚单位疫苗对抵抗PmA8.1菌株的保护效果是100%,两者相比,经LTB-plpE免疫过的小鼠比plpE免疫过的小鼠,发病率明显降低。其次是OmpA,单独构建的OmpA与ISA201佐剂配制成疫苗具有50%的保护效果。